Biology
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छोटी बूंद Barcoding-आधारित एकल कोशिका Transcriptomics वयस्क स्तनधारी ऊतकों
Chapters
Summary January 10th, 2019
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इस प्रोटोकॉल सामांय प्रक्रियाओं और गुणवत्ता नियंत्रण छोटी बूंद-आधारित, उच्च प्रवाह एकल सेल आरएनए-Seq तैयारी के लिए स्वस्थ वयस्क स्तनधारी एकल कोशिकाओं की तैयारी के लिए आवश्यक जांच का वर्णन करता है । अनुक्रमण पैरामीटर, संरेखण पढ़ें, और बहाव एकल-कक्ष bioinformatic विश्लेषण भी प्रदान की जाती हैं ।
Transcript
इस विधि से माइक्रोबायोलॉजी के क्षेत्र में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद मिल सकती है, जैसे चोट या बीमारी के बाद हजारों एकल कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति परिवर्तन को समझना । इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह हमें एक जटिल ऊतक के भीतर व्यक्तिगत कोशिकाओं के ट्रांसक्रिप्टोम को विच्छेदन करने और किसी दी गई आबादी के भीतर कार्यात्मक गतिशीलता की बेहतर सराहना करने की अनुमति देता है। हमारे प्रोटोकॉल का लाभ यह है कि यह प्राथमिक ऊतकों में एकल कोशिकाओं के अलगाव से लेकर इस डेटा सेट के विश्लेषण और दृश्य के लिए व्यापक तरीके प्रदान करता है।
हालांकि यह विधि त्वचा और तंत्रिका से एकल-कोशिका निलंबन से शुरू होती है, लेकिन हम जिन अनुक्रमण विधियों का वर्णन करते हैं, उन्हें किसी भी स्तनधारी ऊतक का अध्ययन करने के लिए लागू किया जा सकता है। इस प्रक्रिया का प्रदर्शन Elodie Labit, और Wisoo शिन, मेरी प्रयोगशाला से दो प्रशिक्षुओं होगा । शुरू करने के लिए, माउस के पीछे के हिंद क्षेत्र से त्वचा को काटने के द्वारा एक इच्छामृत्यु बद्ध माउस की सियाटिक तंत्रिका को काट लें।
जांघ की लंबाई के साथ एक चीरा बनाने के लिए एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का प्रयोग करें। फिर सिस्टिक तंत्रिका को बेनकाब करने और हटाने के लिए ठीक संदंश और कैंची का उपयोग करें। पृष्ठीय पीठ त्वचा को विच्छेदन करने के लिए, कंधे से कंधे तक, दुम के पार, और पीठ के नीचे चीरा लगाने के लिए ठीक संदंश और कैंची का उपयोग करें।
ऊतकों को बर्फ से ठंडे एचबीएसएस से दो बार धोएं। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत, अवांछित संयोजी ऊतक, वसा जमा, या मलबे को हटा दें। केवल त्वचा के लिए, एक बाँझ स्केलपेल ब्लेड का उपयोग करके त्वचा को पतले स्लाइस में काट लें।
त्वचा डर्मिस प्राप्त करने के लिए, 10 सेंटीमीटर डिश में एचबीएसएस में, 30 से 40 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर त्वचा के स्लाइस को डिस्पास में फ्लोट करें। एपिडर्मिस को डर्मिस से छीलने और अलग करने के लिए बारीक संदंश का उपयोग करें, और फिर एपिडर्मिस को त्याग दें। फिर, त्वचा और तंत्रिका के लिए, एक से दो मिलीमीटर टुकड़ों में प्रत्येक नमूने को कीमा बनाने के लिए स्टरल स्केलपेल ब्लेड की एक जोड़ी का उपयोग करें।
ऊतक के टुकड़ों को हौसले से गल, दो ग्राम प्रति मिलीलीटर कोल्ड कोलेजनेस-चार एंजाइम को 15 मिलीलीटर शंकु नली में रखें। एंजाइम में प्रत्येक नमूने को 37 डिग्री सेल्सियस स्नान में हर 10 मिनट में कोमल मिलाते हुए 30 मिनट के लिए इनक्यूबेट करें। 30 मिनट पर, ऊतक को 20 से 30 बार त्रिकोणीय करने के लिए एक P1000 पिपर का उपयोग करें, और पानी के स्नान में लौटें।
हर 30 मिनट में ट्रिट्यूशन दोहराएं जब तक कि समाधान बादल दिखाई न दे, और ऊतक का हिस्सा काफी हद तक अलग हो जाता है। केवल त्वचा के लिए, इनक्यूबेशन के अंतिम घंटे में, त्वचा के नमूने में एक मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर DNAse जोड़ें। चूंकि कुछ सेल प्रकार यांत्रिक तनाव के लिए दूसरों की तुलना में अधिक संवेदनशील होते हैं, इसलिए अत्यधिक वियोजन तकनीक आपकी जनसंख्या को पूर्वाग्रह कर सकती है।
उच्च सेल पैदावार, और ऊतक संरचना का सटीक प्रतिनिधित्व प्राप्त करने के लिए सामान्य वियोजन महत्वपूर्ण है। उसके बाद, प्रत्येक ऊतक नमूने को दो बार फ़िल्टर करने के लिए 50 मिलीलीटर शंकु नली के शीर्ष पर 40 माइक्रोमीटर फिल्टर का उपयोग करें। एक फीसद बीएसए/एचबीएसएस के साथ फिल्टर कुल्ला।
पांडुलिपि में वर्णित नमूनों को अपकेंद्री करने के बाद, एचबीएसएस में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, जिसमें एक प्रतिशत बीएसए होता है, एक व्यापक बोर टिप का उपयोग करके, और बर्फ पर जगह । व्यवहार्यता डाई के अलावा आपको अपनी तैयारी को अनुकूलित करने में मदद मिलेगी। आपको कम से कम 80 प्रतिशत व्यवहार्य कोशिकाओं का लक्ष्य देना चाहिए।
एक बार अनुकूलित होने के बाद, वियोजन प्रक्रिया को तेज करने के लिए इस और अन्य गुणवत्ता-नियंत्रण चरणों को छोड़ा जा सकता है, जो आरएनए की गुणवत्ता को बेहतर संरक्षित करेगा और सेल हानि को कम करेगा। FACS का उपयोग कर व्यवहार्य और स्वस्थ कोशिकाओं को अलग करने के लिए, पहले नमूना संग्रह के लिए बर्फ के आठ मिलीलीटर के साथ 15 मिलीलीटर संकीर्ण नीचे ट्यूब तैयार एक प्रतिशत बीएसए/HBSS । यह सुनिश्चित करने के लिए कि तरल की सतह और ट्यूब के अंदर के बीच इंटरफ़ेस नम है, और स्थिर और सतह तनाव को रोकने के लिए, संग्रह से पहले ट्यूबों को उलटा।
FACS सेल छंटाई के तुरंत बाद, एक बार कोशिकाओं को एक 15 मिलीलीटर ट्यूब में एकत्र कर रहे हैं, एक प्रतिशत बीएसए/HBSS के एक मिलीलीटर का उपयोग करने के लिए धोने और ट्यूब की ओर सतह से नीचे सभी कोशिकाओं धक्का । फिर आठ मिनट के लिए 260 ग्राम पर प्रत्येक नमूना अपकेंद्रित्र करें। सुपरनैंट को त्यागने के बाद, एक प्रतिशत बीएसए/एचबीएसएस में सेल पेलेट को फिर से निलंबित करें, और एक ट्यूब में ३३.८ माइक्रोलीटर जोड़ें, और उस ट्यूब को बर्फ पर रखें ।
यह कदम एक मानकीकृत किट से प्राप्त अभिकर् ती का उपयोग करके किया जा करने के लिए डिज़ाइन किया गया है। निर्माता के निर्देशों का पालन करते हुए सभी प्रदर्शित कदम किए जाने चाहिए। जेम जेनरेशन के लिए तैयार करने के लिए, चिप होल्डर में एक चिप रखें, निर्माता के प्रोटोकॉल के अनुसार, बर्फ पर एक सेल मास्टर मिश्रण तैयार करें।
मास्टर मिक्स के 56.2 माइक्रोलीटर को एक ट्यूब में जोड़ें जिसमें 33.8 माइक्रोलीटर सेल्फ सस्पेंशन होते हैं। चिप तैयार करने के लिए, पहले ५० प्रतिशत ग्लिसरोल पर कुओं के लिए है कि इस्तेमाल नहीं किया जाएगा । फिर सेल मास्टर मिश्रण के 90 माइक्रोलीटर को अच्छी तरह से एक, जेल मोतियों के 40 माइक्रोलीटर को अच्छी तरह से दो में जोड़ें, और विभाजन तेल के 270 माइक्रोलीटर अच्छी तरह से तीन में जोड़ें।
चिप को गैसकेट से ढक दें। चिप लोड करने के लिए, और एक एकल सेल नियंत्रक में चलाने के लिए, पहले ट्रे बाहर निकालें। चिप को ट्रे में रखें।
ट्रे वापस लेना, और खेलने प्रेस। पूरा चलाने के बाद, नमूने के 100 माइक्रोलीटर एकत्र करें, और एक पीसीआर ट्यूब में रखें। पीसीआर ट्यूब को पूर्व निर्धारित पीसीआर मशीन में रखें, और किट के अनुसार चलाएं।
रन के बाद, जीईएम में पॉलीडैनीलेटेड एमआरएनए से पूर्ण लंबाई, बारकोडेड सीडीएनए शामिल होंगे। ट्यूबों को रात भर माइनस 20 डिग्री सेल्सियस पर रखें। पुस्तकालय निर्माण, अनुक्रमण, संरेखण और विश्लेषण के साथ आगे बढ़ें।
एक बार नमूनों को पांडुलिपि में वर्णित के रूप में अनुक्रमित और गठबंधन किया जाता है, तो एनसीबीआई के जियो जैसे सार्वजनिक भंडार पर डेटा जमा करें। ऐसा करने के लिए, सबमिटर खाते के लिए पंजीकरण करें। सबसे पहले मेटाडेटा शीट डाउनलोड कर जियो सबमिशन पूरा करें।
परियोजना प्रस्तुत करने के प्रति केवल एक मेटाडेटा शीट शामिल करने के लिए सुनिश्चित करें। निर्देशिका में स्प्रेडशीट रखें। दूसरा, निर्देशिका में सभी पुस्तकालयों के लिए सेल-रेंजर काउंट स्क्रिप्ट से उत्पन्न कच्चे डेटा फ़ाइल को जोड़ें।
तीसरा फ़ोल्डर प्रोसेस्ड डेटा फाइल है। सभी पुस्तकालयों के लिए सेल-रेंजर काउंट स्क्रिप्ट से उत्पन्न प्रोसेस्ड डेटा फ़ाइलों को निर्देशिका में रखें। तीनों घटकों वाली निर्देशिका को स्थानांतरित करने के लिए जियो सबमिटर के एफटीपी सर्वर क्रेडेंशियल्स का उपयोग करें।
सेल रेंजर चलाने के बाद, विश्लेषण के लिए तैयार जीन बारकोड मैट्रिस को उन्नत जैव सूचनाओं का उपयोग करके आगे संसाधित किया जा सकता है। सबसे पहले, प्री-प्रोसेसिंग मात्रा चेक सेराट आर पैकेज का उपयोग करके किया गया था, जिसने जीन की संख्या, अद्वितीय आणविक पहचानकर्ताओं की संख्या, और सेल डबल्स और आउटलर्स की पहचान करने के लिए माइटोकॉन्ड्रियल जीन के प्रतिशत की कल्पना करने के लिए वायलिन और स्कैटर प्लॉट उत्पन्न किए थे। प्रमुख घटकों, या पीसी के चयन के लिए, कोहनी भूखंडों का उपयोग किया गया था, जिसमें पीसी अक्ष के मानक विचलन के पठार से परे पीसी को बाहर रखा गया था।
क्लस्टरिंग के संकल्प में भी हेराफेरी की गई। कम रिज़ॉल्यूशन के कारण कम सेल क्लस्टर हो गए, प्रत्येक क्लस्टर की संभावना एक परिभाषित सेल प्रकार का प्रतिनिधित्व करती है। उच्च संकल्प उच्च कोशिका संभावना के लिए नेतृत्व किया, उप प्रकार, या संक्रमणकालीन राज्यों का प्रतिनिधित्व, एक सेल आबादी की ।
कम संकल्प क्लस्टर सेटिंग्स का उपयोग किसी दिए गए क्लस्टर में सबसे उच्च व्यक्त जीन की पहचान करने के लिए अभिव्यक्ति हीट मैप्स के आगे विश्लेषण के लिए किया गया था। सेराट के फीचर प्लॉट फ़ंक्शन का उपयोग करके, टीएनएसई भूखंडों पर व्यक्तिगत उम्मीदवार जीन की कल्पना की गई थी, जिसने समझने की अनुमति दी थी, चाहे ऐसे क्लस्टर थे जो उदाहरण के लिए, मैक्रोफेज का प्रतिनिधित्व करते थे। दोनों क्लस्टर दो और चार ने CD68, एक पैन-मैक्रोफेज मार्कर व्यक्त किया ।
अन्य पैकेज गुणवत्ता नियंत्रण के लिए उपकरण भी प्रदान करते हैं, उदाहरण के लिए, मोनोकल, सेल प्रक्षेप पथ के निर्माण के लिए उपयोग किया जाने वाला एक आर पैकेज, खराब गुणवत्ता वाली कोशिकाओं को हटा देता है, और यह सुनिश्चित करता है कि सभी कोशिकाओं में एमआरएनए का वितरण सामान्य लॉग इन किया जाए, और ऊपरी और निचली सीमाओं के बीच गिर गया। एकल कोशिकाओं को तब वर्गीकृत किया गया था और गिना गया था, ज्ञात वंश मार्कर जीन का उपयोग करके, और ब्याज के मार्कर व्यक्त करने वाली कोशिकाओं को सेल प्रकार नंबर एक को सौंपा गया था। यह निर्धारित किया गया था कि सेल प्रकार नंबर एक फाइब्रोब्लास्ट थे।
इस आबादी का आकलन फाइब्रोब्लास्ट विकास पथ बनाने के लिए किया गया था । इस प्रक्रिया के बाद, मात्रात्मक पीसीआर जैसे अन्य तरीकों, सीटू संकरण में, आपके जीन अभिव्यक्ति परिणामों की सटीकता को मान्य करने के लिए एक प्रतिरक्षित रसायन शास्त्र किया जाना चाहिए। एकल सेल mRNA अनुक्रमण अब कई अलग क्षेत्रों में शोधकर्ताओं के लिए सेल से सेल विषमता का पता लगाने के लिए मार्ग प्रशस्त किया है, और होमोस्टेसिस के दौरान विभिन्न ऊतकों के भीतर कार्यात्मक गतिशीलता की पहचान, और कैसे इन चोट के बाद या रोग के विकास में बदल सकते हैं ।
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