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이 문서에서는 집계에 형광 단백질의 효과 형광 기자 들의 맥락에서 새로 새롭거나 형광 단백질의 급속 한 평가 misfolded polyglutamine 확장의 독성을 평가 하기 위해 프로토콜을 설명 합니다.
이 방법은 형광 단백질이 융합 파트너에게 어떤 영향을 미칠 수 있는지와 같은 형광 단백질 분야에서 중요한 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 형광 단백질과 융합 파트너의 효과에 대한 신속하고 쉽게 확장 가능한 평가를 제공한다는 것입니다. 이 방법은 형광 단백질 행동에 대한 통찰력을 제공 할 수 있지만, 다른 유전자 인코딩 태그에도 적용 할 수 있습니다.
또한이 절차를 시연하는 것은 웨스턴 대학의 대학원생인 소냐 디 그레고리오입니다. 이 방법에 의해 시험되는 각 형광 단백질은 먼저 비독성 25Q 반복 또는 헌팅턴 질병 관련 독성 72Q 반복을 수용하는 플래그 태그 HTT 엑온의 갈라토세 유도 할 수 없는 버전을 인코딩하는 효모 발현 벡터로 복제된다. 클론은 시퀀싱에 의해 선택되고 검증되고 이어서 효모로 변환됩니다.
다양한 애사에 대한 세포 배양을 준비하기 위해, 25Q 또는 72Q 태그를 운반하는 효모 클론을 탄소원으로 포도당으로 효모 선택 배지를 함유하는 한천 판에 관심 있는 형광 단백질을 적어 놓는다. 동시에, 25Q 또는 72Q 효모를 운반하는 줄무늬 효모는 양성 제어 역할을 하기 위해 단황 슈퍼폴더 GFP를 최적화했다. 2~3일 동안 섭씨 30도에서 플레이트를 배양합니다.
각 플레이트에서 최대 3개의 단일 콜로니를 선택하고 탄소 원으로 2%의 포도당으로 보충된 합성 완전 배지의 5밀리리터를 접종한다. 하룻밤 사이에 30도에서 문화를 배양하십시오. 다음 날, 각 야간 배양200마이크로리터를 미세원심분리기 튜브및 원심분리기로 이송하여 세포를 펠릿화한다.
멸균 증류수로 적어도 세 번 씻으라. GAL1 프로모터의 유도를 억압하는 데 기여할 수 있는 포도당의 모든 흔적을 제거하기 위해 세포를 잘 씻는 것이 중요합니다. 이전에 입증된 바와 같이 세포를 준비하고 폴리Q 융합의 발현을 유도하기 위해 탄소 원으로서 2%의 갈라토스를 함유한 합성 완전 배지에서 세포를 다시 중단한다.
대조군으로서 포도당 함유 매체에서 세포를 다시 중단한다. 하룻밤 동안 튜브 회전기에서 섭씨 30도에서 세포를 배양하십시오. 다음 날 아침, 분광광계를 사용하여 각 배양의 600 나노미터에서 광학 밀도를 측정합니다.
세포 밀도를 멸균 96웰 플레이트에서 합성 완전 배지 의 100 마이크로리터 에서 2의 광학 밀도 600으로 균등화한다. 이전 우물에서 샘플의 20 마이크로리터를 파이프팅하여 각 샘플의 4개의 5배 희석제를 다음 우물에서 80 마이크로리터의 미디어로 배관하여 준비합니다. 효모 고정 도구를 사용하여 셀을 선택적 플레이트에 발견하고 2 일 동안 섭씨 30도에서 배양하십시오.
이미지 설명서 장치로 플레이트를 이미지화합니다. 이 분석법에 대한 세포 배양을 준비한 다음 분광계를 사용하여 각 배양의 OD600을 측정합니다. 96웰 플레이트에서 300 마이크로리터의 미디어 중 1개 중 OD600으로 세포를 희석시 희석시다.
각 샘플을 삼중으로 준비합니다. 흔들리는 기능을 사용하여 플레이트 판독기 인큐베이터에 플레이트를 배양합니다. 시료 수, 섭씨 30도의 온도, 흡광도 600 나노미터, 실험 의 길이를 24시간으로 설정하고 측정 간격을 15분으로 설정합니다.
연속 흔들림 모드를 선택합니다. 실험이 완료되면 성장 곡선을 만들고 과학 그래프 소프트웨어를 사용하여 곡선 아래 영역을 정량화합니다. 데이터를 세 개의 복제 값으로 XY 테이블에 붙여 넣습니다.
성장 곡선은 왼쪽의 그래프 폴더 아래에 표시됩니다. 곡선 아래 영역을 정량화하려면 왼쪽 위에서 분석하고 XY 분석에서 곡선 아래 영역을 클릭합니다. 준비된 세포를 성장 배지에서 10배 희석하여 이 절차를 시작합니다.
각 샘플의 200마이크로리터를 8웰 이미징 챔버로 옮기습니다. 표준 와이드 필드 형광 현미경을 사용하여 세포를 이미지합니다. 이미지 수집을 위한 이미징 설정을 조정합니다.
72Q 응집체는 확산된 25Q 신호보다 훨씬 밝기 때문에 형광 신호의 포화를 피하기 위해 다른 플라스미드 간에 다른 획득 설정을 사용해야 하는 경우가 많습니다. 적절한 이미지 처리 소프트웨어를 사용하여 이미지를 처리합니다. 이 프로토콜에서, 닷 블롯은 단백질 발현 수준을 검사하기 위하여 이용됩니다.
페닐메틸설포닐 불소의 4마이크로몰라와 리시스 완충제에 프로테아제 억제제 칵테일을 추가하여 단백질 용액생성을 위한 완충액을 준비한다. 펠릿 원심 분리에 의해 각 하룻밤 문화의 다섯 밀리리터. 유리 구슬의 200 마이크로 리터와 200 개의 용해 버퍼에서 세포를 다시 중단합니다.
12라운드 동안 30초 동안 소용돌이가 회전합니다. 원심분리기는 섭씨 4도에서 12, 000배 G로 10분 동안 상주합니다. 마이크로 여과 장치를 사용하여 니트로 셀룰로오스 막에서 동일한 양의 총 단백질을 발견하십시오.
PBS로 멤브레인을 미리 적시고 장치를 조립합니다. 진공 소스에 연결하고 나사를 조여 있는지 확인합니다. 시료를 적재하고, 진공을 켜고, 시료가 중력에 의해 멤브레인을 통해 필터를 할 수 있도록 합니다.
PBS 05%Tween 5%의 무지방 우유를 30분 동안 막에 블롯합니다. 하룻밤 사이에 섭씨 4도에서 1 차적인 항플래그 항체로 막을 배양하십시오. 다음 날, PBS 05%Tween으로 각각 10분 동안 멤브레인을 세 번 씻는다.
PBS 05%Tween 5%의 지방 이차 항체에서 1시간 동안 실온에서 형광으로 표시된 이차 항체로 멤브레인을 배양합니다. PBS 05%Tween으로 멤브레인을 각각 10분 동안 세 번 씻으시다. 그 후, 아미노 블롯 문서화 시스템을 사용하여 멤브레인을 이미지.
효모는 효모에 융합된 25Q 또는 72Q HTT 엑슨 1개를 효모에 최적화된 단량형 슈퍼폴더 GFP 또는 효모 최적화 단황 태그 BFP2는 하룻밤 사이에 포도당 또는 갈라토스 배지에서 배양하여 한천판에서 발견되거나 액체 매체에서 더 많이 배양하였다. 반면 72Q 효모최적화 단황 슈퍼폴더 GFP는 상당한 성장 결함을 유도한다. 72Q 효모 최적화 단황 태그 BFP2는 형광 태그의 특성이 세포에서 폴리Q 확장 거동을 방해할 수 있음을 나타내는 비독성 25Q 대응과 유사한 성장 표현형을 나타낸다.
형광 현미경 검사법에 의한 형광 폴리Q 융합의 집계 평가는 72Q 효모최적화 된 단황 슈퍼폴더 GFP가 상당한 응집을 표시하는 반면, 72Q 효모 최적화 단황 태그 BFP2는 무독성 25Q 대응과 유사한 확산 된 세포질 신호를 표시합니다. 다양한 폴리Q 퓨전의 발현 수준이 독성에 영향을 줄 수 있기 때문에, 도트 블롯은 단백질 수치를 평가하기 위해 수행되었다. 세포 용양의 5 배 희석의 결과가 표시됩니다.
이 기술은 GFP 이체와 특징되지 않은 형광 단백질의 신속한 비교를 허용하지만, 직접 올리고머화를 평가할 수 없다는 것을 잊지 마십시오. 이 절차에 이어, 다른 측정, 예를 들어, 포유류 세포내궤양 분석체는 형광 단백질의 단황 상태와 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있다.
