הביטוי ולטיהור TRPC3 האדם רגיש השומנים הקטיון ערוץ לקביעת מבניים על-ידי הקפאה יחיד-חלקיקים-מיקרוסקופ

פרוטוקול זה איפשר לנו לפתור את המבנה של TRPC3 האנושי, חבר במשפחה חשובה, אך understudied של ערוצי יון. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא היעילות הגבוהה שבה ניתן ליישם אותה כדי לבטא ולטהר מגוון חלבונים, הן למחקרים מבניים והן למחקרים פונקציונליים. שיטה זו יכולה לספק ביטוי חלבון יעיל מערכת טיהור, לשימוש בחקר ביוכימיה של חלבון ביופיזיקה והוא יכול להיות מיושם על מגוון רחב של ערוצי יונים וחלבוני קרום אחרים.

ראשית, בדוק את ביטוי הנגיף היחסי על ידי הצגת פלואורסצנטיות GFP של הנגיף בדגימה של תרבות ייצור הנגיף. בבקבוק תרבות ארלנפייר נמוך ומבולבל בגודל מספיק, הכינו נפח רצוי של תרבות מתלים של תאי יונקים HEK293, בריכוז של 3.5 עד 3.8 מיליון תאים למיליליטר במדיום הביטוי, בתוספת FBS סטרילי של 1%. הוסף 8% לפי נפח של פתרון מלאי וירוס P2 מוכן דגירה שייקר מסלולית ב 37 מעלות צלזיוס ו 135 סל”ד.

ב 12 עד 18 שעות לאחר ההדבקה להוסיף 10 מילימולר נתרן butyrate, דגירה ב 30 מעלות צלזיוס למשך הזמן הדרוש לביטוי חלבון אופטימלי. לאחר מכן, צנטריפוגה ב 2, 880 פעמים כבידה במשך 20 דקות כדי לקצור את התאים. לשטוף ו resuspend התאים בערך 100 מיליליטר של TBS לליטר של תאים שנקטפו.

צנטריפוגה שוב ב 2, 880 פעמים כבידה במשך 20 דקות ולאסוף את גלולת התא. גם לאסוף קטן, כדורי תא אחד מיליליטר יבולים בנקודות זמן שונות מתבודד במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס עם תסיסה בנוכחות חומרי ניקוי שונים ו / או תוספים. להבהיר אלה דגימות מנוכלות תאים שלמים קטנים על ידי אולטרהצנטריות ב 235, 000 פעמים כבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.

לאחר מכן, הפעל אותם כ-30 דגימות מיקרוליטר בעמודת כרומטוגרפיה של SEC, כדי לקבוע את הזמן הטוב ביותר לביטוי ואת תנאי המיסות הטובים ביותר. להפשיר את גלולה ב 100 מיליליטר של חיץ לליטר של תאים שנקטפו. לאחר התאים מופשרים, פיפטה או מערבבים אותם כדי להבטיח את הפתרון הוא הומוגני.

תן לתאים להתבודד בארבע מעלות צלזיוס בפקעת שקועה בקרח במשך שעתיים תוך ערבוב על ידי בר ערבוב. לאחר מכן, להסיר את כל פסולת התא על ידי אולטרהצנטריפוגה ב 235, 000 פעמים כוח הכבידה בארבע מעלות צלזיוס במשך שעה אחת. הפעל דגימת 30 מיקרוליטר של העל-טבעי בעמודת SCC של HPLC כדי לאמת את כמות החלבון ולהמחיש את חלבון היעד באמצעות פלט אות GFB.

החל את שרפי זיקה קובלט קשור על טבעי המכיל את החלבון מנוכר על עמוד הכבידה ולאסוף את הזרימה דרך. הפעל מדגם 30 microliter של זרימה דרך על עמודת SCC כדי לוודא החלבון מחייב את רשף. לאחר מכן, לשטוף את וסף עם 10 כרכים עמודה של מאגר.

הפעל מדגם 30 microliter של לשטוף על עמודת SCC כדי לבדוק אובדן חלבון. באמצעות מאגר, להשתיק את שרף מאוגד TRPC3 האנושי. הפעל מדגם 90 microliter של eluant כי כבר מדולל אחד עד 100 על עמודת SSC כדי לבדוק כי החלבון כבר eluted ולאמת את נוכחותו של אות GFP במיקום המתאים לגודל חלבון היעד.

מוסיפים את טרומבין ביחס של 1 עד 20 טוחנות ומוסיפים 10 מילימולרים של EDTA לדגימה האלוטה. דגירה בארבע מעלות צלזיוס במשך שלוש שעות. לאחר מכן, להעביר את eluant לצינור מסנן צנטריפוגלי 15 מיליליטר.

סובב את הצינור בכבידה של פי 2, 800 וב-4 מעלות צלזיוס במרווחים של חמש דקות כדי לרכז את האלונט ל-500 מיקרוליטרים או פחות. פיפטה פתרון החלבון למעלה ולמטה בין ספינים כדי resuspend החלבון ולמנוע ריכוז יתר. טען את הריכוז בעמודת SSC במאגר.

הפעל כרומטוגרפיה נוזלית חלבון מהיר ולאסוף 300 שברי microliter. לאחר מכן, שלב את שברי השיא המכילים את הטטרמר TRPC3 כפי שהודמיין על ידי אות ספיגת UV. ולהתרכז שוב לריכוז סופי של לפחות חמישה מיליגרם למיליליטר.

TRPC3 האנושי הוא תא שלם מנושל במגוון של חומרי ניקוי עם ריכוז micelle קריטי של 0.01 כדי 20 micromolars, ו נוהלה במאגר DDM / CHS המכיל. למרות DDM / CHS מראה את המבודדות הגבוהה ביותר של TRPC3 האנושי, מיקום השיא נראה גדול מדי כדי להיות TRPC3 האנושי tetrameric. לאחר מסיסות תאים שלמים פסולת תמיסת התא מוסרת ואת החלבון מסיס נטען על עמודת SSC ולהפעיל על HPLC ב DDM / CHS דטרגנט המכיל חיץ, כדי להשוות את המסיסות המוחלטת ואת נפח השיא של TRPC3 אנושי בתנאים שונים יחסית לבקרת TRPM4.

כל דגימות TRPC3 מנושל דטרגנט שונים להראות עמדות שיא סביב 11.9 מיליליטר אשר סביר גדול מדי כי הצורה tetrameric של TRPC3 אנושי יש משקל מולקולרי קטן יותר מאשר TRPM4 שליטה אנושית חיובית. שני מאגרי מינון והפעלה שונים המכילים DDM/CHS ודיגיטונין נבדקים לאחר מכן. החלבון פועל במאגר המכיל דיגיטונין מניב את הפסגה הגבוהה ביותר במיקום סביר יחסית לשליטה החיובית.

בעוד טיהור בקנה מידה קטן באמצעות 25 מיליליטר של תאים מראה כמה פסגות רחבות, החלבון מראה תכונות של ערוץ TRPC3 אנושי tetrameric יחיד בסיווג 2D על ידי כתם שלילי. תוספים מוקרנים לאחר מכן בהתבסס על האופי הפיזיולוגי של TRPC3 האנושי. EDTA מראה השפעה יוצאת דופן על ייצוב TRPC3 האנושי במצב שיא tetrameric שלם והגדיל באופן משמעותי את מספר החלקיקים במיקרוגרף cryo-EM והפחית את הרעש ברקע.

איכות התוצאות הסופיות תלויה בפתרון בעיות טוב של פרופילי FSCC ב- HPLC. ועל השלמת כל צעדי הטיהור במהירות, באופן אידיאלי ביום אחד. נחישות מבנית, ייצור נוגדנים, מחקרים פונקציונליים כגון, בדיקות מחייבות או אלקטרופיזיולוגיה יכול להתבצע לאחר הליך זה.

טכניקה זו יכולה והותאמה לחקר תעלות יון ומשפחות חלבון אחרות ולייצר חלבונים מטוהרים ליישומים מעבר לנחישות מבנית. יש לנקוט באמצעי הזהירות המתאימים לניהול biohazards של תרבות התאים כגון עבודה במכסה המנוע של זרימה למינארית, לבישת ביגוד מגן, סילוק נכון של פסולת.