Genetics
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कैंसर सेल क्लोन की पीढ़ी Telomeric दोहराने-युक्त आरएनए टेरा कल्पना करने के लिए जीवित कोशिकाओं में एक एकल Telomere से व्यक्त
Summary January 17th, 2019
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यहां, हम एक एकल subtelomere में एक MS2 अनुक्रम टैग युक्त कैंसर सेल क्लोन उत्पंन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । इस दृष्टिकोण, MS2 पर भरोसा-GFP प्रणाली, telomeric दोहराने युक्त आरएनए (टेरा) के अंतर्जात टेप के दृश्य में सक्षम बनाता है रहने वाले कोशिकाओं में एक ही telomere से व्यक्त की ।
Transcript
इस विधि से टेलोमेरेस के बारे में महत्वपूर्ण सवालों के जवाब देने में मदद मिल सकती है, जैसे खमीर टेलोमेरिक नॉनकोडिंग आरएनए टेरा स्थानीयकरण, और मैं इस बात पर जोर दे सकता हूं कि यह मूल का टेलोमेरे है या ट्रांस में, एक अलग क्रोम्स-मैंट्स इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह शोधकर्ताओं को जीवित कोशिकाओं में एक टेलोमेरे से टेरा अणुओं को व्यक्त करने की अनुमति देता है। प्रक्रिया का प्रदर्शन क्लाउडियो ओस पेगोरर और निकोल बेटटिन, मेरी प्रयोगशाला से दो स्नातक छात्र होंगे। पाठ प्रोटोकॉल के अनुसार एजीएस कोशिकाओं को विकसित करना शुरू करना।
फिर जब कोशिकाएं 50 से 60% संगम तक पहुंचती हैं तो उन्हें वेक्टर और एमएस 2 कैसेट व्यक्त करने वाले sgRNA Cas9 के साथ स्पेक्ट करें। अगले दिन खेती माध्यम को नियोमाइसिन युक्त माध्यम से प्रतिस्थापित करें। इसके बाद 96 अच्छी प्लेट के प्रत्येक कुएं में 0.25% ट्रिपसिन के 10 माइक्रोलीटर जोड़ें।
माइक्रोस्कोप और एक मार्कर का उपयोग करके, डिश में दिखाई देने वाले प्रत्येक क्लोन की स्थिति को चिह्नित करें। क्लोन पर तरल की एक पतली फिल्म बनाने के लिए पर्याप्त पीबीएस के साथ नियोमाइसिन संस्कृति माध्यम को बदलें। ट्राइप्सिन के पांच माइक्रोलीटर युक्त 10 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके, धीरे-धीरे ट्राइप्सिन को कॉलोनी पर छोड़ दें।
ट्रिप्सिन को एक मिनट के लिए कोशिकाओं को अलग करने की अनुमति दें। टिप के साथ कॉलोनी को कुरेदें, और इसे टिप में चूसें। इसके बाद, कॉलोनी से कोशिकाओं को 96 अच्छी प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें।
कमरे के तापमान पर पांच मिनट के लिए थाली इनक्यूबेट। इसके बाद चुनिंदा माध्यम के 150 माइक्रोलीटर से कुएं को भरें। इसके बाद, तीन 96 अच्छी प्लेटों के प्रत्येक कुएं में जिलेटिन के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें।
30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर प्लेटों को इनक्यूबेट करें, और प्लेटों को पीबीएस के साथ दो बार धोएं। क्लोन 90% संगम तक पहुंचने के बाद, प्लेट के प्रत्येक कुएं से माध्यम को एस्पिरेट करें, और प्लेट को पीबीएस से धोएं। फिर प्रत्येक कुएं में ट्रिप्सिन के 30 माइक्रोलीटर जोड़ें, और प्लेट को पांच मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
इसके बाद, प्रत्येक कुएं में चुनिंदा माध्यम के 70 माइक्रोलीटर जोड़ें। ऊपर और नीचे पाइपिंग करके कोशिकाओं को बाधित करें। मिश्रण के 30 माइक्रोलीटर को जिलेटिनीकृत डीएनए प्लेट के कुएं में स्थानांतरित करें जिसमें चयनात्मक माध्यम के 120 माइक्रोलीटर होते हैं।
फिर मिश्रण के 30 माइक्रोलीटर को जिलेटिनीकृत फ्रीजिंग प्लेट में स्थानांतरित करें जिसमें मध्यम के 50 माइक्रोलीटर होते हैं। डीएनए को इनक्यूबेटर में रखें, और कोशिकाओं को 90% संगम तक पहुंचने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर बढ़ने दें। इसके बाद, ठंड प्लेट के प्रत्येक कुएं में बर्फ ठंड ठंड माध्यम के 80 माइक्रोलीटर जोड़ें।
प्लेट को पैराफिल्म से सील करें, ढक्कन को बदलें, और प्लेट को एल्यूमीनियम फॉयल में लपेटें। इसके बाद फ्रीजिंग प्लेट्स को 80 डिग्री सेल्सियस पर रखें। डीएनए प्लेट में क्लोन 90% संगम तक पहुंचने के बाद, दो बार पीबीएस के साथ प्लेट धोएं।
फिर लाइसिस बफर के 50 माइक्रोलीटर के साथ कोशिकाओं को लाइसे करें। प्लेट को पैराफिल्म से ढककर, ढक्कन को बदलें, और थाली को सारण लपेटें में लपेटें। इसके बाद रात भर 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली को इनक्यूबेट करें।
अगले दिन प्रत्येक कुएं में इथेनॉल सोडियम क्लोराइड समाधान के 100 माइक्रोलीटर जोड़ें, और कमरे के तापमान पर छह घंटे या रात भर के लिए डीएनए वर्षा की अनुमति दें। फिर प्लेट को उलटा करें और इसे 200 माइक्रोलीटर इथेनॉल 70% प्रति अच्छी तरह से धोएं। RNase के 20 माइक्रोलीटर प्लेट के प्रत्येक कुएं के लिए एक समाधान जोड़ें, और एक घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट ।
इसके बाद पीसीआर एम्पलीफिकेशन के लिए जीनोमिक डीएनए के तीन माइक्रोलीटर का इस्तेमाल करें और पीसीआर मशीन को सेटअप करें । टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार छह अच्छी प्लेटों में पीसीआर पॉजिटिव क्लोन बढ़ाएं। एक बार क्लोन 90% संगम तक पहुंचने के बाद, कोशिकाओं को पीबीएस से धोएं, और प्रत्येक अच्छी तरह से प्रोटीनेज कश्मीर के साथ लाइसिस बफर के 250 माइक्रोलीटर जोड़ें।
कोशिकाओं को कुरेदने के लिए सेल स्क्रैपर का उपयोग करें, और लिसेट को 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में स्थानांतरित करें। 16 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर Lysate इनक्यूबेट। Lysate करने के लिए इथेनॉल का एक मिलीलीटर जोड़ें, और सख्ती से हिला।
क्लोन को टेक्स्ट प्रोटोकॉल के अनुसार एफ-12K माध्यम में बढ़ने दें। फिर 70% संगम तक पहुंचने के बाद कोशिकाओं में क्रे-एक्सप्रेसिंग एडेनोवायरस जोड़ें। संक्रमण के 48 घंटे बाद कोशिकाओं को तीन 10 सेंटीमीटर व्यंजनों में विभाजित करें।
फिर सेल फ्रीजिंग, और आरएनए निष्कर्षण के लिए तीसरे व्यंजन संस्कृति। सबसे पहले, ग्लास बॉटम डिश में टेरा-एमएस2 क्लोन और जंगली प्रकार एजीएस कोशिकाओं को प्लेट करें। फिर मध्यम में रेट्रोवायरस व्यक्त करते हुए पॉलीब्रेन और एमएस2-जीएफपी जोड़ें।
24 घंटे के बाद रेट्रोवायरस युक्त माध्यम को त्यागें, और कोशिकाओं में फिनोल लाल के बिना ताजा माध्यम जोड़ें। अंत में, एक उल्टे माइक्रोस्कोप और एक संवेदनशील कैमरा छवि उचित उद्देश्य और एपर्चर के साथ कोशिकाओं का उपयोग कर । इस प्रोटोकॉल में कैंसर सेल क्लोन एक ही सबटेलोमेरे पर एक MS2 अनुक्रम टैग युक्त बनाया और छवि थे ।
नियोमाइसिन प्रतिरोधी क्लोन पीसीआर का उपयोग कर जांच की गई। जीनोमिक डीएनए निष्कर्षण और दक्षिणी दाग विश्लेषण के लिए सकारात्मक क्लोन को सुसंस्कृत किया गया था। पीसीआर और दक्षिणी दाग विश्लेषण के लिए सकारात्मक क्लोन MS2 कैसेट में मौजूद नियोमाइसिन जीन को हटाने के लिए Adenovirus व्यक्त सीआरई-GFP से संक्रमित थे ।
एक बार नियोमाइसिन प्रतिरोध जीन के उन्मूलन की पुष्टि हो जाने के बाद, क्लोन से निकाले गए आरएनए का परीक्षण टेरा-एमएस2 ट्रांसक्रिप्ट की अभिव्यक्ति के लिए किया गया था। कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी द्वारा जीवित कोशिकाओं में टेरा-एमएस2 ट्रांसक्रिप्ट की कल्पना करने के लिए, चयनित क्लोन MS2-GFP फ्यूजन प्रोटीन व्यक्त करते हुए रेट्रोवायरस से संक्रमित थे। टेरा-एमएस2 ट्रांसक्रिप्ट और टेलोमेरेस को चयनित क्लोनों में एमएस2-जीएफपी फ्यूजन प्रोटीन और एक रीचेरी फ्यूज्ड टेलोमेरे बाइंडिंग प्रोटीन, टीआरएफ 2 को सह-व्यक्त करके कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से जीवित कोशिकाओं में एक साथ कल्पना की गई थी।
इस प्रक्रिया का प्रयास करते समय क्लोन की मिश्रित आबादी के बजाय एक क्लोन का चयन करने के लिए हर संभव प्रयास करना महत्वपूर्ण है। इस प्रक्रिया के बाद, गुणसूत्र फैलता पर एक डीएनए मछली की तरह अन्य तरीकों, क्रम में तय कोशिकाओं में MS2 कैसेट के एकीकरण की कल्पना करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इसके विकास के बाद, यह तकनीक टेलोमेरेस के क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए जीवित मानव कोशिकाओं में एकल टेलोमेरे टेरा अणुओं के सेलुलर स्थानीयकरण का पता लगाने का मार्ग प्रशस्त कर सकती है।
मत भूलना कि वायरल वैक्टर और रेडियोधर्मी सामग्री के साथ काम करना बेहद अनिश्चित हो सकता है। और इस तरह के प्रयोगशाला कोट, दस्ताने पहनने और विकिरण को कम करने के लिए प्लेक्सीग्लास ढाल का उपयोग कर के रूप में सावधानियों, हमेशा लिया जाना चाहिए जब इस प्रक्रिया का प्रदर्शन ।
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