Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 20 seconds.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generation af kræft celle kloner til at visualisere Telomeric Repeat-holdige RNA TERRA udtrykt fra en enkelt Telomer i levende celler
Summary January 17th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi præsenterer her, en protokol for at generere kræft celle kloner indeholdende en MS2 sekvens tag på en enkelt subtelomere. Denne tilgang, lid MS2-normal god landbrugspraksis system, giver mulighed for visualisering af de endogene afskrifter af telomeric repeat-holdige RNA (TERRA) udtrykt fra en enkelt Telomer i levende celler.
Transcript
Denne metode kan hjælpe med at besvare centrale spørgsmål om Telomeres, såsom gær telomeric noncoding RNA TERRA lokalisering, og jeg kan insistere på, at det er telomere af oprindelse eller i trans, en anden cromes-mants Den største fordel ved denne teknik er, at det giver forskerne mulighed for at visualisere TERRA molekyler udtrykke fra en enkelt telomere i levende celler. Demonstration af proceduren vil være Claudio Oss Pegorar og Nicole Bettin, to kandidatstuderende fra mit laboratorium. For at begynde at dyrke AGS-celler i henhold til tekstprotokollen.
Så når cellerne nå 50 til 60% sammenløb transspect dem med sgRNA Cas9 udtrykke vektor og MS2 kassette. Den næste dag erstatte dyrkning medium med medium, der indeholder Neomycin. Efter denne tilføje 10 mikroliter af 0,25% Tripsyn til hver brønd af en 96 brønd plade.
Ved hjælp af et mikroskop og en markør skal du markere placeringen af hver klon synlig i skålen. Udskift Neomycin-dyrkningsmediet med nok PBS til at danne en tynd film af væske på klonerne. Ved hjælp af en 10 mikroliterpipette, der indeholder fem mikroliter Trypsin, skal du langsomt slippe Trypsin på kolonien.
Lad Trypsin løsne cellerne i et minut. Skrab kolonien med spidsen, og suge den op i spidsen. Derefter overføres cellerne fra kolonien til en brønd af 96 brøndpladen.
Pladen inkuberes i fem minutter ved stuetemperatur. Fyld derefter brønden med 150 mikroliter selektivt medium. Dernæst tilsættes 100 mikroliter gelatine til hver brønd af tre 96 brøndplader.
Pladerne inkuberes ved stuetemperatur i 30 minutter, og pladerne vaskes to gange med PBS. Når klonerne når 90% sammenløb, aspirere mediet fra hver brønd af pladen, og vask pladen med PBS. Derefter tilsættes 30 mikroliter trypsin til hver brønd, og inkubere pladen ved 37 grader celsius i fem minutter.
Dernæst tilsættes 70 mikroliter selektivt medium til hver af brøndene. Forstyrre cellerne ved pipettering op og ned. Overfør 30 mikroliter af blandingen til brønden af den gelatinerede DNA-plade, der indeholder 120 mikroliter selektivt medium.
Derefter overføres 30 mikroliter af blandingen til den gelatiniserede fryseplade, der indeholder 50 mikroliter medium. Placer DNA i inkubatoren, og lad cellerne til at vokse ved 37 grader celsius, indtil de når 90% sammenløb. Efter dette, tilsættes 80 mikroliter iskold frysning medium til hver brønd af frysepladen.
Forsegle pladen med parafilm, erstatte låget, og wrap pladen i aluminiumsfolie. Hold derefter frysepladerne ved 80 grader celsius. Når klonerne i DNA-pladen når 90%sammenløb, vaskes pladen med PBS to gange.
Derefter lyse cellerne med 50 mikroliter af Lysis buffer. Dæk pladen med parafilm, udskift låget, og pak pladen ind i saran wrap. Herefter inkuberes pladen ved 37 grader celsius natten over.
Den næste dag tilsættes 100 mikroliter ethanol natriumchlorid opløsning til hver brønd, og lad DNA nedbør i seks timer eller natten over ved stuetemperatur. Derefter vende pladen og vaske det tre gange med 200 mikroliter ethanol 70% per brønd. Tilsæt 20 mikroliter RNase En opløsning til hver brønd af pladen, og inkuber pladen ved 37 grader celsius i en time.
Derefter skal du bruge tre mikroliter genomisk DNA til PCR-forstærkning og sætte PCR-maskinen op. Dyrk PCR-positive kloner i seks brøndplader i henhold til tekstprotokollen. Når klonerne når 90%sammenløb, vaske cellerne med PBS, og tilsæt 250 mikroliter af Lysis buffer med Proteinase K til hver brønd.
Brug en celleskraber til at skrabe cellerne og overføre lysatet til et 1,5 milliliterrør. Inkuber lysatet ved 37 grader celsius i 16 timer. Tilsæt en milliliter ethanol til lysatet, og ryst kraftigt.
Lad klonerne vokse i F-12K-medie i henhold til tekstprotokollen. Derefter tilsættes Cre-udtrykkende adenovirus til cellerne, når de når 70% sammenløb. 48 timer efter infektion, opdele cellerne i tre 10 centimeter retter.
Derefter kultur den tredje retter til celle frysning, og RNA ekstraktion. Først plade TERRA-MS2 kloner og den vilde type AGS celler i glasbunden retter. Derefter tilsættes Polybrene og MS2-GFP udtrykke retrovirus til mediet.
Efter 24 timer kassér mediet indeholdende retrovirus, og tilsæt frisk medium uden phenol rød til cellerne. Endelig ved hjælp af en omvendt mikroskop og et følsomt kamera billede cellerne med det rette mål og blænde. I denne protokol kræft celle kloner, der indeholder en MS2 sekvens tag på en enkelt subtelomere blev oprettet og afbildet.
Neomycin resistente kloner blev screenet ved hjælp af PCR. De positive kloner blev dyrket ved lysed for genomisk DNA-ekstraktion og sydlig blot analyse. Klonerne positive for PCR og southern blot analyse blev inficeret med CRE-GFP udtrykke Adenovirus for at fjerne Neomycin genet til stede i MS2 kassette.
Når elimineringen af neomycinresistensgenet blev bekræftet, blev RNA udvundet fra klonerne testet for ekspression af TERRA-MS2-udskrifter. For at visualisere TERRA-MS2 udskrifter i levende celler ved konfokal mikroskopi, de udvalgte kloner blev inficeret med en retrovirus udtrykke en MS2-GFP fusion protein. TERRA-MS2 udskrifter og telomerer blev samtidig visualiseret i levende celler via konfokal mikroskopi ved co-udtrykke MS2-GFP fusion protein og en mCherry smeltet telomere bindende protein, TRF2, i de udvalgte kloner.
Når du forsøger denne procedure er det vigtigt at gøre alt for at vælge en enkelt klon i stedet for en blandet population af kloner. Efter denne procedure, andre metoder som en DNA-fisk på kromosom spreads, kan bruges til at visualisere integrationen af MS2 kassette i faste celler. Efter sin udvikling, denne teknik kan bane vejen for forskere inden for telomerer at udforske den cellulære lokalisering af enkelt telomere TERRA molekyler i levende menneskelige celler.
Glem ikke, at arbejde med virale vektorer og radioaktive materialer kan være yderst usikker. Og forholdsregler, såsom iført lab frakker, handsker og ved hjælp af plexiglas skjolde for at minimere stråling bør altid tages, når du udfører denne procedure.
Related Videos
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
CH
DE