Biology
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Prélèvement du sperme de qualité différentielle en utilisant la Centrifugation en Gradient de densité
Chapters
Summary November 29th, 2018
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Dans cet article, nous visons à décrire les performances de la technique de centrifugation en gradient de densité et de son application dans la recherche de la physiologie de sperme.
Transcript
Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la physiologie du sperme, telles que les déterminats chimiques de la qualité du sperme. Le principal avantage de cette technique est sa capacité à séparer de grandes quantités d’échantillon par qualité, ainsi que l’adaptabilité par rapport aux méthodes alternatives. Bien que cette méthode puisse fournir un aperçu des différences dans la qualité du sperme, elle peut également être appliquée à d’autres échantillons tels que les types de cellules mixtes ou les composants subcellulaires avec des densités différentes.
Pour commencer, faire deux dilutions Percoll de 3 millilitres dans deux tubes séparés. Dans un tube à essai propre, diluer 1 millilitre d’échantillon de sperme avec 2 millilitres de PBS. Pipe doucement pour mélanger la solution.
Ajouter 3 millilitres de la sollution percoll de basse densité à un tube conique stérile. Ensuite, pipette soigneusement 3 millilitres de la solution Percoll de densité plus élevée sous la solution Percoll de faible densité. Tout en inclinant le tube conique à un angle de 45 degrés, pipette 3 millilitres de l’échantillon de sperme dilué sur le dessus du gradient de densité Percoll.
Après avoir préparé un tube blanc, centrifuger les deux tubes à 1500 Gs pendant 20 minutes. Assurez-vous que trois couches distinctes de sperme se sont formées dans la baignoire après centrifugation. À l’aide d’une pipette recueillir les trois couches de sperme, en commençant par la couche supérieure, suivie par la couche moyenne, et se terminant par la pastille dure au fond du tube.
Transférer chacune des couches dans un tube stérile de micro centrifugeuse. Diluer chacun des échantillons de sperme avec 1,5 millilitres de PBS et centrifuger les échantillons à 1500 Gs pendant dix minutes. Enfin, versez le supernatant et reconstituez les granulés avec tampon de motilité.
Dans ce protocole, la technique de centrifugation du gradient de densité Percoll, ou PDGC, a été utilisée pour séparer un échantillon de sperme en trois couches distinctes. Le sperme se sépare en une couche de haute qualité au-dessous de la solution de densité plus élevée, une couche de qualité moyenne entre les solutions de densité plus élevée et inférieure, et une couche de faible qualité au-dessus de la solution de basse densité. Ces différences dans la qualité du sperme sont démontrées par des différences dans la viabilité, la mobilité et la pénétrabilité.
Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler que les échantillons doivent être amenés à température ambiante. Le succès de PDGC dépend d’une préparation minutieuse du gradient ainsi que d’une collecte minutieuse des couches isolées. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à nos recherches dans le domaine de la perdiomics de sperme pour explorer les marqueurs biologiques de la fertilité chez les espèces aviaires.
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