Biology
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Raccolta di sperma di qualità differenziale mediante centrifugazione in gradiente di densità
Chapters
Summary November 29th, 2018
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In questa carta, ci proponiamo di descrivere le prestazioni della tecnica di centrifugazione su gradiente di densità e la sua applicazione nella ricerca di fisiologia di sperma.
Transcript
Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della fisiologia dello sperma, come i determinati chimici della qualità dello sperma. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di separare grandi quantità di campione per qualità, così come l'adattabilità rispetto a metodi alternativi. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle differenze nella qualità dello sperma, può anche essere applicato ad altri campioni come tipi di cellule miste o componenti subcellulari con densità diverse.
Per iniziare, fare due diluizioni Percoll da 3 millilitri in due tubi separati. In una provetta pulita, diluire 1 millilitro di campione di sperma con 2 millilitri di PBS. Tubazione delicatamente per mescolare la soluzione.
Aggiungere 3 millilitri della solluizione Percoll a bassa densità a un tubo conico sterile. Quindi, pipettare con cura 3 millilitri della soluzione Percoll ad alta densità sotto la soluzione Percoll a densità inferiore. Mentre si inclina il tubo conico con un angolo di 45 gradi, pipettare 3 millilitri del campione di sperma diluito sopra il gradiente di densità di Percoll.
Dopo aver preparato un tubo vuoto, centrifuga entrambi i tubi a 1500 G per 20 minuti. Assicurarsi che tre distinti strati di sperma si siano formati nella vasca dopo la centrifugazione. Utilizzando una pipetta raccogliere i tre strati di sperma, iniziando con lo strato superiore, seguito dallo strato intermedio, e terminando con il pellet duro nella parte inferiore del tubo.
Trasferire ciascuno degli strati in un tubo di micro centrifuga sterile. Diluire ciascuno dei campioni di sperma con 1,5 millilitri di PBS e centrifugare i campioni a 1500 G per dieci minuti. Infine, versare il supernatante e ricostituire i pellet con tampone di motilità.
In questo protocollo, la tecnica di centrifugazione del gradiente di densità percoll, o PDGC, è stata utilizzata per separare un campione di sperma in tre strati distinti. Lo sperma si separa in uno strato di alta qualità al di sotto della soluzione a densità più elevata, uno strato di media qualità tra le soluzioni a densità superiore e inferiore e uno strato di bassa qualità sopra la soluzione a densità inferiore. Queste differenze nella qualità degli spermatozoi sono evidenziate da differenze di vitalità, mobilità e penetrabilità.
Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che i campioni devono essere portati a temperatura ambiente. Il successo del PDGC dipende da un'attenta preparazione del gradiente e da un'attenta raccolta degli strati isolati. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha spianato la strada alla nostra ricerca nel campo della perdiomica degli spermatozoi per esplorare bio marcatori di fertilità nelle specie aviari.
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