Biology
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Coleção de esperma de qualidade diferencial usando centrifugação gradiente de densidade
Chapters
Summary November 29th, 2018
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Neste trabalho, pretendemos descrever o desempenho da técnica de centrifugação gradiente de densidade e sua aplicação na investigação de fisiologia de esperma.
Transcript
Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo da fisiologia do esperma, como os determinantes químicos da qualidade do esperma. A principal vantagem desta técnica é a capacidade de separar grandes quantidades de amostra por qualidade, bem como adaptabilidade quando comparada a métodos alternativos. Embora este método possa fornecer insights sobre as diferenças na qualidade do esperma, ele também pode ser aplicado a outras amostras, como tipos de células mistas ou componentes subcelulares com densidades diferentes.
Para começar, faça duas diluições percoll de 3 mililitros em dois tubos separados. Em um tubo de ensaio limpo, dilui 1 mililitro de amostra de sêmen com 2 mililitros de PBS. Pipe-o suavemente para misturar a solução.
Adicione 3 mililitros da sollução percoll de menor densidade a um tubo cônico estéril. Em seguida, cuidadosamente pipeta 3 mililitros da solução Percoll de maior densidade sob a solução Percoll de menor densidade. Enquanto inclina o tubo cônico em um ângulo de 45 graus, pipeta 3 mililitros da amostra de sêmen diluído em cima do gradiente de densidade percoll.
Depois de preparar um tubo em branco, centrifugar ambos os tubos a 1500 Gs por 20 minutos. Assegurar que três camadas distintas de sêmen se formaram na banheira após a centrifugação. Usando uma pipeta coletar as três camadas de sêmen, começando com a camada superior, seguida pela camada média, e terminando com a pelota dura na parte inferior do tubo.
Transfira cada uma das camadas para um tubo micro centrífuga estéril. Diluir cada uma das amostras de sêmen com 1,5 mililitros de PBS e centrifugar as amostras a 1500 Gs por dez minutos. Finalmente, despeje o supernatante e reconstitua as pelotas com tampão de motilidade.
Neste protocolo, a técnica de centrifugação de gradiente de densidade percoll, ou PDGC, foi usada para separar uma amostra de sêmen em três camadas distintas. O esperma se separa em uma camada de alta qualidade abaixo da solução de maior densidade, uma camada de qualidade média entre as soluções de densidade mais alta e inferior, e uma camada de baixa qualidade acima da solução de densidade inferior. Essas diferenças na qualidade do esperma são evidenciadas por diferenças na viabilidade, mobilidade e penetrabilidade.
Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que as amostras precisam ser levadas à temperatura ambiente. O sucesso do PDGC depende da preparação cuidadosa do gradiente, bem como da coleta cuidadosa das camadas isoladas. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para nossa pesquisa no campo da perdiômica de esperma para explorar biomarcadores de fertilidade em espécies aviárias.
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