Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Многоцветная потока на основе цитометрии количественная оценка митохондрии и лизосом в Т-клеток
Chapters
Summary January 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Эта статья показывает мощный метод количественного определения митохондрий или лизосом в живых клетках. Сочетание конкретных Лизосома или митохондрии красители с дневно конъюгированных антител против поверхностных маркеров позволяет количественная оценка этих органеллы в смешанных клеточных популяций, как первичной клетки заготавливаемым от образцов тканей, с использованием многоцветная проточной цитометрии.
Transcript
Этот метод может помочь нам ответить на ключевые вопросы в области иммуно-метаболизма. Преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет количественно определить митохондрии или лизосомы в отдельных живых клетках, в сложной смеси различных типов клеток. Этот метод для изучения Т и В клеток также может быть применен ко многим другим типам клеток, таких как макрофаги, дендритные клетки, или любые первичные клетки, собранные из образца ткани.
Процедуру продемонстрирует Чин-Вэнь Вэй, аспирант моей лаборатории. Чтобы маркировать органеллы для количественной оценки, во-первых, добавьте один раз десять к шестой Т-клеток мыши к одной круглой нижней трубке факса на маркер. И гранулировать клетки центрифугой.
предварительно разогретый до 37 градусов по Цельсию сыворотки свободной культуры среды разбавить органеллы конкретных растворов зонда запасов для окончательной рабочей концентрации в среде. И повторно приостановить клетки в 100 микролитров зонд красителя на трубку. Далее, инкубировать клетки в инкубаторе культуры клеток для соответствующего периода окрашивания, останавливая реакцию в конце инкубации с одним миллилитром ледяного буфера факса на трубку.
Затем соберите клетки с другой центрифугации и повторно приостановить гранулы в 100 микролитров предварительно титрованные 24G2 гибридомы супернатант на льду. Через десять минут добавьте один миллилитр буфера факса на трубку. Соберите клетки центрифугации и этикетки клеток с 50 микролитров предварительно титрованные флуоресценции конъюгированных антител коктейль интерес.
Добавьте соответствующую концентрацию в соответствии с таблицей. И факс буфер в течение 20 минут на льду, защищенный от света. В конце инкубации добавьте один миллилитр буфера факса на трубку.
Соберите клетки путем центрифугации. И повторно приостановить клетки в 300 микролитров буфера факса дополняется одним микрограммом на миллилитр иодида пропидия. Сразу же после добавления ядерного и хромосомного счетчика включите компьютер цитометрического анализа потока, цитометр потока, программное обеспечение для приобретения факсов и любые другие аксессуары в зависимости от платформы машины.
Запуск PBS через систему в течение примерно одной минуты, чтобы убедиться, что поток линии заполнены PBS и sheathe буфера. Откройте новый эксперимент и установите параметры цитометра в соответствии с инструкциями производителя. Фильтр клетки через 70 микрометровый ситечко клетки.
И вихрь до приобретения каждого образца, чтобы избежать комков и двойного образования. Откройте параметр автоматической компенсации и создайте точечные участки для каждого флуоресцентного параметра. После того, как все напряжения были установлены, отрегулируйте компенсацию и примените компенсацию к образцам.
Создайте форвардный рассеяние по сравнению с боковым рассеянием участка и оптимизируйте напряжение, чтобы ячейки, представляющие интерес, появлялись в сюжете. Создайте вперед рассеяния по сравнению с вперед рассеяния высота участка и ворота одного ячейки. Создайте вперед рассеяния области по сравнению с боковой области рассеяния участка и ворота лимфоцитов.
Создайте перемотка вперед области по сравнению с пропидия йодида участок и ворота живых клеток. После того, как все напряжения были установлены, отрегулируйте компенсацию и примените компенсацию к образцам. Затем загрузите первую пробную трубку, создайте соответствующие участки маркера поверхности клетки и соберите не менее 1000 событий населения, представляющих интерес.
Когда все образцы будут запущены, экспортите данные потока для последующего анализа. И сохранить эксперимент в качестве шаблона для сохранения параметров цитометра и параметров для подобных экспериментов в будущем. Окончательное митохондриальное содержимое сайта является самым низким в двойном отрицательном одной Т-клеток, пик на двойной отрицательной стадии два и три, и незначительное снижение в двойном отрицательном этапе четыре.
С двойными положительными тимоцитами, демонстрирующими большее количество митохондрий, чем CD4 и CD8 одиночных положительных тимоцитов, что свидетельствует о том, что митохондриальное содержание колеблется во время развития. CD4 и CD8 одиночные положительные тимоциты exhibit более высокая митохондриальная средняя интенсивность флуоресценции чем splenic CD4 или CD8 T клетки, предлагая что наивные Т-клетки которые recirculate в окружающей среде крови кислорода богатые люди имеют даже более низкую митохондриальную массу чем тимоциты. Интересно, что это сокращение митохондриального содержания является более заметным в CD8, чем CD4 T клеточной линии, и активация Т-клеток еще больше уменьшает присутствие этих органелл.
Относительно низкое, но обнаруживаемое лизосомальное содержание наблюдается во всех популяциях тимоцитов, при этом более заметное присутствие в двойном отрицательном тимоцитах. На периферии относительно большое количество лизосом обнаруживается в памяти и эффекторе CD8 положительных Т-клеток. Сочетание органеллы конкретных красителей и поверхностного маркера с цитометрией потока является мощным способом характеристики метаболического состояния клеток в сложной смеси.
Дополнительный органель специфический краситель может быть использован для обнаружения эндоплазмической ритикулум, аутофагический вакуол, или другой внутриклеточный отсек интереса.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
