Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Multicolor flöde flödescytometri-baserade kvantifiering av mitokondrier och lysosomer i T-celler
Chapters
Summary January 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denna artikel visar en kraftfull metod för att kvantifiera mitokondrier eller lysosomer i levande celler. Kombinationen av Lysosomen - eller mitokondrierna-specifika färgämnen med fluorescently konjugerade antikroppar mot ytmarkörer tillåter kvantifiering av dessa organeller i blandad cellpopulationer, som primära celler skördas från vävnadsprover, med hjälp av multicolor flödescytometri.
Transcript
Denna metod kan hjälpa oss att svara på viktiga frågor inom området för immunmetabolism. Fördelen med denna teknik är att den tillåter kvantifiering av mitokondrier eller lysosomer i enskilda levande celler, i en komplex blandning av olika celltyper. Denna metod för att studera T- och B-celler kan också tillämpas på många andra celltyper som makrofager, dendritiska celler eller eventuella primära celler som skördats från ett vävnadsprov.
Förfarandet kommer att demonstreras av Chin-Wen Wei, en doktorand från mitt laboratorium. För att märka organellerna för kvantifiering, först, lägga till en gånger tio till sjätte mus T-celler till en rund botten faxrör per markör. Och pellet cellerna genom centrifugeringen.
förvättnad till 37 grader Celsius serumfritt odlingsmedium för att späda ut de organellspecifika sondlagerlösningarna till slutliga arbetskoncentrationer i mediet. Och åter upphäva cellerna i 100 mikroliter sond färgämne per rör. Därefter inkubera cellerna i en cellodling inkubator för lämplig infärgning period, stoppa reaktionen i slutet av inkubationen med en milliliter iskall fax buffert per rör.
Samla sedan cellerna med en annan centrifugering och åter upphäva pellets i 100 mikroliter av den pre-titrerade 24G2 hybridoma supernatant på is. Efter tio minuter, tillsätt en milliliter faxbuffert per rör. Samla in cellerna genom centrifugering och märk cellerna med 50 mikroliter av den förtitreraterade fluorescenskonjugerade antikroppscocktailen av intresse.
Tillsätt lämplig koncentration enligt tabellen. Och faxbuffert i 20 minuter på is, skyddad mot ljus. I slutet av inkubationen, tillsätt en milliliter faxbuffert per rör.
Samla in cellerna genom centrifugeringen. Och åter avbryta cellerna i 300 mikroliter faxbuffert kompletteras med ett mikrogram per milliliter av propidium iodid. Omedelbart efter att lägga till kärn-och kromosom counterstain, slå på flödet cytometer analys dator, flödescytometer, fax förvärv programvara, och eventuella andra tillbehör enheter beroende på maskinen plattform.
Kör PBS genom systemet i ungefär en minut för att säkerställa att flödeslinjen fylls med PBS och SHEATHE buffert. Öppna ett nytt experiment och ställ in cytometerparametrarna enligt tillverkarens anvisningar. Filtrera cellerna genom en 70 mikrometer cell sil.
Och virvel före förvärvet av varje prov för att undvika klumpar och doublet formation. Öppna inställningen Auto komsering, och skapa punktytningar för varje fluorescerande parameter. När alla spänningar har ställts in, justera kompensationen och tillämpa ersättningen på proverna.
Skapa en framåt scatter kontra sida scatter plot och optimera spänningarna så att de celler av intresse visas inom observationsområdet. Skapa en framåt scatter kontra framåt scatter höjd tomt och grind de enstaka cellerna. Skapa en framåt scatter område kontra sida scatter område tomt och gate lymfocyterna.
Skapa en framåt scatter område kontra propidium iodid tomt och grind de levande cellerna. När alla spänningar har ställts in, justera kompensationen och tillämpa ersättningen på proverna. Ladda sedan det första provröret, skapa lämpliga cellytan markör tomter, och samla in minst 1, 000 händelser av befolkningen av intresse.
När alla av proverna har körts, exportera flödesdata för efterföljande analys. Och spara experimentet som en mall för att bevara cytometerinställningarna och parametrarna för liknande experiment i framtiden. Slutlig webbplats mitokondriellt innehåll är den lägsta i dubbel negativ en T-celler, topp på dubbel negativ etapp två och tre, och något minska i dubbla negativa steg fyra.
Med dubbla positiva thymocyter som visar högre antal mitokondrier än CD4 och CD8 enda positiva thymocyter, vilket tyder på att mitokondriellt innehåll fluktuerar under utvecklingen. CD4 och CD8 enda positiva thymocyter uppvisar en högre mitokondriellt medelvärde fluorescens intensitet än splenic CD4 eller CD8 T celler, vilket tyder på att naiva T-celler som recirculate i syre rika blod miljön har en ännu lägre mitokondriellt massa än thymocyter. Intressant nog är denna minskning av mitokondriellt innehåll mer framträdande i CD8 än CD4 T cellen härstamning, och T-cellen aktiveringen minskar ytterligare förekomsten av dessa organeller.
Relativt låg, men detekterbara, lysosomala innehåll observeras i alla tymocyte populationer, med en mer framträdande närvaro i dubbel negativ en thymocyter. I periferin detekteras ett relativt högt antal lysosomer i minnes- och effektor-CD8-positiva T-celler. Att kombinera organellspecifika färgämnen och ytmarkör med flödescytometri är ett kraftfullt sätt att karakterisera cellernas metaboliska status i en komplex blandning.
Ytterligare organell specifikt färgämne kan användas för att upptäcka endoplasmatisk reticulum, autophagic vacuole, eller andra intracellulära delutrymme av intresse.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
