Immunology and Infection
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ミトコンドリア、リソソーム T 細胞のマルチカラー フロー フローサイトメトリーを用いた定量化
Chapters
Summary January 9th, 2019
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この記事は、ミトコンドリアや細胞内のリソソームを定量化する強力な方法を示しています。リソソームやミトコンドリア固有染料表面マーカー蛍光に活用された抗体との組み合わせにより、初代培養細胞を用いた組織サンプルから収穫のような混合細胞集団におけるこれらのオルガネラの定量化フローサイトメトリー マルチ カラー。
Transcript
この方法は、免疫代謝分野における重要な質問に答える手助けとなります。この技術の利点は、異なる細胞タイプの複雑な混合物中で、個々の生細胞におけるミトコンドリアまたはリソソームの定量化を可能にすることである。T細胞およびB細胞を研究するためのこの方法は、マクロファージ、樹状細胞、または組織サンプルから採取された任意の一次細胞のような他の多くの細胞タイプにも適用することができる。
この手順は、私の研究室の大学院生であるチンウェン・ウェイによって実証されます。定量のためにオルガネラにラベルを付けるには、まず、6番目のマウスT細胞に10回10回、マーカーごとに1つの丸い底のファックスチューブに1回追加します。遠心分離により細胞をペレット化する。
37°Cに摂氏血清フリー培養培地に予め温め、オルガネラ特異的プローブストック溶液を培地中の最終的な作業濃度に希釈する。そして、チューブ当たり100マイクロリットルのプローブ染料で細胞を再懸濁する。次に、細胞培養インキュベーター内で適切な染色期間をインキュベートし、チューブ当たり1ミリリットルの氷冷ファックスバッファーでインキュベーション終了時の反応を停止する。
次いで、別の遠心分離で細胞を収集し、氷上で前滴定された24G2ハイブリドーマ上清の100マイクロリットルでペレットを再懸濁する。10分後、チューブあたり1ミリリットルのファックスバッファを追加します。遠心分離によって細胞を収集し、対象の事前滴定蛍光結合抗体カクテルの50マイクロリットルで細胞にラベルを付けます。
表に従って適切な濃度を加えます。そして、光から保護された氷の上で20分間ファックスバッファ。インキュベーションの終わりに、チューブあたり1ミリリットルのファックスバッファーを追加します。
遠心分離によって細胞を収集します。そして、ヨウ化プロピジウム1ミリリットル当たり1マイクログラムで補ったファックスバッファーの300マイクロリットルで細胞を再懸濁する。核および染色体カウンターステインを添加した直後に、フローサイトメーター分析コンピュータ、フローサイトメーター、ファクス取得ソフトウェア、および機械プラットフォームに応じて他のアクセサリデバイスをオンにします。
システムを通して約1分間PBSを実行し、フローラインがPBSとシーザバッファで満たされていることを確認します。新しい実験を開き、メーカーの指示に従ってサイトメーターのパラメータを設定します。70マイクロメートルの細胞のストレーナーを通して細胞をフィルターします。
そして、各サンプルの取得前に渦は、塊やダブレット形成を避けるために。[自動補正]設定を開き、各蛍光パラメータにドットプロットを作成します。すべての電圧を設定した後、補正を調整し、サンプルに補正を適用します。
前方散布図対側面散布図を作成し、対象セルがプロット内に表示されるように電圧を最適化します。前方散布図と前方散乱高さプロットを作成し、単一セルにゲートを付けます。前方散乱領域対側面散乱領域プロットを作成し、リンパ球をゲートします。
ヨウ化プロピジウムプロットとの前方散乱領域を作成し、生きた細胞をゲートします。すべての電圧を設定した後、補正を調整し、サンプルに補正を適用します。次に、最初のサンプルチューブをロードし、適切なセル表面マーカープロットを作成し、対象の母集団の少なくとも1,000個のイベントを収集します。
すべてのサンプルが実行されたら、後続の分析のためにフローデータをエクスポートします。そして、将来的に同様の実験のためにサイトメーターの設定とパラメータを保存するためのテンプレートとして実験を保存します。最終部位のミトコンドリア内容物は、二重陰性1T細胞において最も低く、二重陰性ステージ2および3でピークを迎え、二重陰性ステージ4でわずかに減少する。
二重陽性胸腺細胞はCD4およびCD8単一陽性胸腺細胞よりも多くのミトコンドリアを示し、ミトコンドリアの内容物が発達中に変動することを示唆している。CD4およびCD8単一陽性胸腺細胞は、脾臓CD4またはCD8 T細胞よりも高いミトコンドリア平均蛍光強度を示し、酸素が豊富な血液環境で再循環するナイーブT細胞は、胸腺細胞よりもさらに低いミトコンドリア質量を有することを示唆している。興味深いことに、このミトコンドリア内容物の減少はCD8においてCD4T細胞系統よりも顕著であり、そしてT細胞活性化はこれらのオルガネラの存在をさらに減少させる。
比較的低いが検出可能なリソソーム内容物は、すべての胸腺細胞集団において観察され、二重陰性の1つの胸腺細胞においてより顕著な存在である。周辺では、比較的多くのリソソームがメモリおよびエフェクターCD8陽性T細胞で検出される。細胞質特異的な色素と表面マーカーをフローサイトメトリーと組み合わせることは、複雑な混合物中の細胞の代謝状態を特徴付ける強力な方法です。
追加のオルガネラ特異的な色素は、小胞体、オートファジー性空胞体、または他の細胞内の関心のある区画を検出するために使用することができる。
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