Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Verifiserer nikotinsyre acetylcholin reseptor-funksjonen i musen hjernen skiver via Laser Flash Photolysis Photoactivatable nikotin
Chapters
Summary January 25th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne artikkelen presenterer en metode for å studere nikotinsyre acetylkolin reseptorer (nAChRs) i musen hjernen skiver av nikotin uncaging. Når kombinert med samtidige oppdateringen klemme opptak og 2-fotonet laserskanning mikroskopi, forbinder nikotin uncaging nikotinsyre reseptoren funksjonen med cellular morfologi, gir en dypere forståelse av cholinergic nevrobiologi.
Transcript
Denne teknikken utnytter multi-foton laserskanning mikroskopi i forbindelse med laser-flash fotolyse av en fotoaktiverbar nikotin molekyl. Tillater presis aktivering av nikotinkolinerge reseptorer. Denne teknikken gir mulighet for fin spatiotemporal kontroll over nikotinreseptoragonistapplikasjon, noe som gir et kraftig verktøy for studiet av reseptorfunksjonelle uttrykksmønstre og kolinerge synaptisk eller volumoverføring.
Før du begynner prosedyren, bruk en programmerbar pipette avtrekker til å trekke en glassmikropipette med en 20-til 40-mikrometeråpningsdiameter. Stamme omtrent en milliliter opptaksløsning gjennom et 0,22-mikronfilter. Og resuspend nok lyofilisert fotoaktiverbar nikotin i den filtrerte opptaksløsningen for å gi en to millimolar endelig konsentrasjon.
Fyll tilbake den trekkede lokale applikasjonsmikropipetten med 50 mikroliter av det fotoaktivatable stoffet, og fest pipetten i en pipetteholder montert på en mikromanipulator. Koble pipetteholderen via en passende slangelengde til et trykkutstøtingssystem som er i stand til vedvarende lavtrykksapplikasjon. Og bruk mikromanipulatoren til å manøvrere den lokale applikasjonspipetten i den ekstracellulære opptaksløsningen.
Plasser pipettespissen litt over en mushjernevevsprøve, ca. 50 mikrometer fra interessecellen. Og kort bruke en til to pounds per kvadrattomme av trykk på pipetten. Det bør være minimal eller ingen forskyvning av cellen av interesse.
Etter å ha oppnådd en stabil helcelleplastklemme, slå på den lave applikasjonen på trykkutstøtingsenheten, og metter vevet rundt cellen med fotoaktiverbar nikotin i ett til to minutter. Lokal applikasjon introduserer ekstra kompleksitet til eksperimentet. Men det sparer sammensatte og tillater høyere konsentrasjoner av PA-Nic som skal benyttes.
For bad påføring av fotoaktiverbar nikotin oppløses først nok av det lyofiliserte stoffet i et volum av opptaksløsning som passer for kontinuerlig resirkulering til en 100 mikromolar endelig konsentrasjon. Og last den resulterende blandingen inn i et perfusjonssystem. Deretter begynner resirkulering av den fotoaktive nikotinløsningen med en hastighet på 1,5 til 2 millimeter per minutt, ved hjelp av rør med minimal indre diameter og total lengde for å minimere det nødvendige resirkuleringsvolumet.
Under resirkulering, kontinuerlig boble løsningen med karbaogen, og opprettholde badetemperaturen ved 32 grader Celsius under dårlige lysforhold. Bath søknad drar nytte av enkelhet og ensartethet av PA-Nic permeasjon av vevet. Men det bruker nødvendigvis lavere mikromolar PA-Nic konsentrasjoner, og bruker høyere totale mengder sammensatte.
For live visualisering av en medial habenula neuron, bruk overført lys eller infrarød differensial interferens kontrast optikk og et videokamera for å etablere en stabil, helcellet patch klemme opptak. Etter å ha etablert den høymotstandscelle-tilkoblede konfigurasjonen, men før innbrudd, bytter du oppsettet og programvaren til laserskanningsmodus. Etter innbrudd, bruk laserskanning for å bekrefte at bildefargen av interesse passivt fyller nevronen ved diffusjon.
La fargestoffet fylle cellulære rom i minst 20 til 30 minutter før du bruker live scan-funksjonen til å visualisere nevronen og det subcellulære rommet av interesse. Velg bildeparametere som tillater en nøyaktig live visualisering av de nevronale funksjonene, manipulere de riktige innstillingene for å påvirke eller endre skjermvisualisering, oppløsning, signal-til-støy-forhold og bilderammeanskaffelsestid etter behov. For å forbedre signalkontrasten åpner du oppslagstabellvinduet og justerer oppslagsbordet og takinnstillingene.
Hvis du vil finne et interesseområde i vevet, velger du 1X optisk zoom og bruker panoreringskontrollene. Bruk Z-serien til å velge en start- og stoppposisjon som inneholder cellen av interesse. Angi en trinnstørrelse på ett mikrometer, og velg en bildestørrelse som gir et bilde med høyest oppløsning.
Ofte 1, 024 med 1, 024 piksler per linje. Deretter bilde neuronet i hvert Z-plan som inneholder cellen. For å kalibrere laserstimuleringen, start systemskanningen med en bildelasereffekt som er større enn minimum, og finjuster objektivfokuset på det tynne røde markørfluorescenslaget.
Velg et område i fluorescensfeltet uten rusk og jevnt belagt med markør, og åpne verktøy-, kalibrerings- og justeringsmenyen for å velge den uavklarende galvokalibreringsfunksjonen. Følg brenne flekker opplæringen for romlig kalibrering av den andre galvanometer speil par, velge 405-nanometer laser, en laser stimulering kraft på 400, og en stimulering varighet på 20 millisekunder. For å gi en-til-fem-mikrometer diameter hull i den røde markøren.
Velg oppdatering for å stimulere og oppdatere bildet etter midtpunktbrenningen, og flytt den runde røde indikatoren til den faktiske spotplasseringen til de midterre, midtre og nedre midtpunktene for å få et rutenett på ni punkter. Hvis du vil teste kalibreringen, åpner du merkepunktvinduet og aktiverer stimuleringsparametrene for de definerte flekkene manuelt i et nytt område av prøven, og tar vare på at den riktige siste kalibreringsfilen lastes inn i merkepunktvinduet. Påfør deretter en testpuls for å verifisere riktig kalibrering.
Hvis du vil bilde av og finne det subcellulære interesseområdet, velger du live scan og bruker øke den optiske zoomen til å visualisere eventuelle små strukturer etter behov. Plasser markpunktet enkeltflekks trådkors umiddelbart ved siden av cellemembranen, og sett fotostimuleringsparametrene til en 1-50-millisekund varighet, en en-til fire-milliwatt laserkraft og minst en studie. Velg deretter kjøremerkepunkter for å starte markpunktprotokollen, og observere elektrofysiologidatainnsamlingen i sanntid.
Fotoaktiv nikotin 2PE fluorescens av en millimolar PA-Nic oppdages lett under trykkutstøting fra en lokal applikasjonpipette som demonstrert. Mens levering av de viktigste fotokjemiske produktene av den fotoaktive nikotinfotolysereaksjonen ikke genererer noe fluorescerende signal ved samme konsentrasjon og eksitasjonskraft og bølgelengde. Viser spesifisiteten til de fotoaktive nikotinresultatene.
Avbildning av fotoaktiverbar nikotin som påføres hjernevevet som demonstrert avslører tilstedeværelsen av stoffet innen 100 til 200 mikrometer av den lokale applikasjonspipetten. Bekrefter at fotoaktiverbar nikotin effektivt kan leveres til hjernevevet via lokal applikasjon. Her er bilder av høy kvalitet der den nevronale morfologien ser ut til å være komplett, støyen minimeres, og ruskene forstyrrer ikke tolkningen av cellulær morfologi, vises.
Disse bildene er imidlertid av lavere kvalitet. På grunn av et lavere signal-til-bakgrunn-forhold og betydelig rusk. Paring to-foton laser skanning mikroskopi av mediale habenula nevroner i hjernen skiver med laser flash fotolyse av PA-Nic som demonstrert, gjør det mulig for avstemming av elektrofysiologiske responser med cellulær morfologi.
Fotolyse på ett punkt som utføres med 10-sekunders intervaller, gir tilstrekkelig restitusjonstid for grunnlinjeholdestrømmen. Mens et kortere intervall på ett sekund fører til en gradvis økning i holdestrømmen etter hvert som protokollen fortsetter. Noe som tyder på at nikotinet ikke har nok tid til å spre seg bort fra systemet med kortere intervaller.
Ved å utforme eksperimenter som bruker fotoaktive molekyler, er det viktig å huske å velge fluorescerende indikatorer og rapportere fluoroforer med kompatible eksitasjonsutslippsspektra. PA-Nic er kompatibel med de vanligste fluoroforene på grunn av sin korte bølgelengde fotolyse topp. Når du velger den mest hensiktsmessige PA-Nic-applikasjonsteknikken, er det viktig å nøye vurdere det funksjonelle uttrykket, den fysiologiske aktiviteten til nikotinreseptorene i nevronene av interesse.
Dyktig utnyttelse av denne teknikken gir mulighet for fin spatiotemporal kontroll av nikotinapplikasjon, noe som muliggjør spennende nye muligheter for å studere kinetikken til innfødt nikotinreseptorengasjement, subcellulær lokalisering og modulering av nevronal aktivitet ved nikotinreseptoraktivering.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
