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January 25, 2019
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Esta técnica aproveita a microscopia de varredura a laser multi-fóton em conjunto com fotolise laser-flash de uma molécula de nicotina fotoativat. Permitindo ativação precisa de receptores colinérgicos nicotínicos. Esta técnica permite um controle espástico fino sobre a aplicação agonista do receptor nicotínico, fornecendo uma ferramenta poderosa para o estudo de padrões de expressão funcional receptor e transmissão sináptica ou de volume colinérgico.
Antes de iniciar o procedimento, use um puxador de pipeta programável para puxar uma micropipette de vidro com um diâmetro de abertura de 20 a 40 micrômetros. Coe aproximadamente um mililitro da solução de gravação através de um filtro de 0,22 mícron. E resuspenque nicotina fotoativat suficiente na solução de gravação filtrada para produzir uma concentração final de dois milimiliar.
Enchimento do micropipette de aplicação local puxado com 50 microliters da droga fotoativa, e fixar a pipeta em um suporte de pipeta montado em um micromanipulador. Conecte o suporte de pipeta através de um comprimento apropriado de tubulação a um sistema de ejeção de pressão capaz de aplicação sustentada de baixa pressão. E use o micromanipulador para manobrar a pipeta de aplicação local na solução de gravação extracelular.
Posicione a ponta da pipeta ligeiramente acima de uma amostra de tecido cerebral do rato, aproximadamente 50 micrômetros da célula de interesse. E aplique brevemente de um a dois quilos por polegada quadrada de pressão na pipeta. Deve haver mínimo a nenhum deslocamento da célula de interesse.
Depois de alcançar um grampo de remendo de células inteiras estáveis, ligue a aplicação baixa no dispositivo de ejeção de pressão e satura o tecido ao redor da célula com nicotina fotoativadora por um a dois minutos. A aplicação local introduz complexidade adicional ao experimento. Mas poupa compostos e permite que maiores concentrações de PA-Nic sejam utilizadas.
Para a aplicação do banho da nicotina fotoativa, primeiro dissolva o suficiente da droga liofilizada em um volume de solução de gravação apropriada para recirculação contínua a uma concentração final de 100 micromolar. E carregue a mistura resultante em um sistema de perfusão. Em seguida, inicie a recirculação da solução fotoativa de nicotina a uma taxa de 1,5 a 2 milímetros por minuto, usando tubos com um diâmetro interno mínimo e comprimento geral para minimizar o volume de recirculação necessário.
Durante a recirculação, bolha continuamente a solução com carbogen, e manter a temperatura do banho em 32 graus Celsius sob condições de baixa luz. A aplicação do banho beneficia-se da simplicidade e uniformidade da permeação pa-nic do tecido. Mas ele necessariamente utiliza concentrações de PA-Nic de micromolar mais baixas, e gasta maiores quantidades totais de compostos.
Para visualização ao vivo de um neurônio habenula medial, use luz transmitida ou câmera diferencial infravermelha e uma câmera de vídeo para estabelecer uma gravação estável de grampo de remendo de células inteiras. Depois de estabelecer a configuração de alta resistência anexada por células, mas antes da invasão, mude a configuração e o software para o modo de varredura a laser. Após a invasão, use escaneamento a laser para verificar se o corante de imagem de interesse está preenchendo passivamente o neurônio por difusão.
Deixe que o corante preencha os compartimentos celulares por pelo menos 20 a 30 minutos antes de usar a função de varredura ao vivo para visualizar o neurônio e o compartimento subcelular de interesse. Selecione parâmetros de imagem que permitam uma visualização ao vivo precisa dos recursos neuronais, manipulando as configurações apropriadas para afetar ou alterar a visualização do display, resolução, relação sinal-ruído e tempo de aquisição do quadro de imagem, conforme necessário. Para melhorar o contraste do sinal, abra a janela da tabela de procuração e ajuste as configurações do piso e do teto da mesa de parece.
Para localizar uma área de interesse dentro do tecido, selecione o zoom óptico de 1X e use os controles de panorâmica. Use a ferramenta série Z para selecionar uma posição de início e parada que contenha a célula de interesse. Defina um tamanho de passo de um micrômetro e selecione um tamanho de imagem que renderá uma imagem de maior resolução.
Muitas vezes 1.024 por 1.024 pixels por linha. Em seguida, imagem consecutiva do neurônio em cada plano Z que contém a célula. Para calibrar a estimulação do laser, inicie a varredura do sistema com uma potência laser de imagem maior que o mínimo, e ajuste o foco objetivo na fina camada de fluorescência do marcador vermelho.
Selecione uma área dentro do campo de fluorescência livre de detritos e revestida uniformemente com marcador, e abra o menu de ferramentas, calibração e alinhamento para selecionar a função de galvanização desacentada. Siga o tutorial de pontos de queimadura para a calibração espacial do segundo par de espelhos galvanômetros, selecionando o laser de 405 nanômetros, um poder de estimulação a laser de 400 e uma duração de estimulação de 20 milissegundos. Para produzir furos de um a cinco centímetros de diâmetro no marcador vermelho.
Selecione a atualização para estimular e atualizar a imagem após a queima do ponto central e mova o indicador vermelho redondo para a localização real dos pontos central, centro-direito e centro inferior para obter uma grade de nove pontos. Para testar a calibração, abra a janela de pontos de marca e ative manualmente os parâmetros de estimulação dos pontos definidos em uma nova área da amostra, tomando cuidado para que o arquivo de calibração mais recente correto seja carregado na janela de pontos de marca. Em seguida, aplique um pulso de teste para verificar a calibração correta.
Para visualizar brevemente e localizar a área subcelular de interesse, selecione digitalização ao vivo e use o zoom óptico para visualizar quaisquer pequenas estruturas conforme necessário. Coloque a mira de ponto de marca imediatamente adjacente à membrana celular, e defina os parâmetros de fotostimulação para uma duração de um a 50 milissegundos, uma potência laser de um a quatro miliwatts e pelo menos um teste. Em seguida, selecione pontos de marca de execução para iniciar o protocolo de pontos de marca e observe a aquisição de dados de eletrofisiologia em tempo real.
Fluorescência de nicotina 2PE fotoativante de pa-nic de um mililitro é facilmente detectada durante a ejeção de pressão de uma pipeta de aplicação local como demonstrado. Considerando que a entrega dos principais produtos fotoquímicos da fotolise fotoativatável da reação de fotolise de nicotina não gera nenhum sinal fluorescente na mesma concentração e poder de excitação e comprimento de onda. Demonstrando a especificidade dos resultados fotoativados da nicotina.
A imagem da nicotina fotoativat aplicada ao tecido cerebral como demonstrado revela a presença da droga dentro de 100 a 200 micrômetros da pipeta de aplicação local. Confirmando que a nicotina fotoativa pode ser efetivamente entregue ao tecido cerebral através da aplicação local. Aqui, imagens de alta qualidade dentro das quais a morfologia neuronal parece estar completa, o ruído é minimizado, e os detritos não interferem na interpretação da morfologia celular, são mostrados.
Essas imagens, no entanto, são de menor qualidade. Devido a uma menor relação sinal-fundo e detritos substanciais. Emparelhar microscopia de escaneamento a laser de dois fótons de neurônios de habenula medial em fatias cerebrais com fotolise flash laser de PA-Nic como demonstrado, permite a reconciliação das respostas eletrofisiológicas com morfologia celular.
A fotolise de ponto único realizada em intervalos de 10 segundos permite um tempo de recuperação suficiente para a corrente de retenção da linha de base. Enquanto um intervalo mais curto de um segundo leva a um aumento gradual da corrente de espera à medida que o protocolo prossegue. Sugerindo que a nicotina não tem tempo suficiente para difundir para longe do sistema com os intervalos mais curtos.
Ao projetar experimentos que utilizem moléculas fotoativas, é importante lembrar de selecionar indicadores fluorescentes e relatar fluoroforos com espectros de emissão de excitação compatíveis. Pa-Nic é compatível com fluoroforos mais comuns devido ao seu curto pico de fotolise de comprimento de onda. Ao escolher a técnica de aplicação pa-nic mais adequada, é importante considerar cuidadosamente a expressão funcional, atividade fisiológica dos receptores nicotínicos nos neurônios de interesse.
A utilização qualificada desta técnica permite um bom controle espostetemporal da aplicação da nicotina, o que permite novas possibilidades interessantes para estudar a cinética do engajamento do receptor nicotínico nativo, localização subcelular e modulação da atividade neuronal pela ativação do receptor nicotínico.
Este artigo apresenta um método para estudar os receptores nicotínicos de acetilcolina (nAChRs) em fatias de cérebro de rato por nicotina uncaging. Quando acoplado com gravação de braçadeira do remendo simultânea e 2-fóton laser, microscopia eletrônica de varredura, nicotina uncaging conecta a função do receptor nicotínico com morfologia celular, proporcionando uma compreensão mais profunda da neurobiologia colinérgico.
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Arvin, M. C., Wokosin, D. L., Banala, S., Lavis, L. D., Drenan, R. M. Probing Nicotinic Acetylcholine Receptor Function in Mouse Brain Slices via Laser Flash Photolysis of Photoactivatable Nicotine. J. Vis. Exp. (143), e58873, doi:10.3791/58873 (2019).
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