A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Isolering och kultur av embryonala mus neurala stamceller
Chapters
Summary November 11th, 2018
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här introducerar vi en ny mikrokirurgisk teknik för isolering av neurala stamceller från E13 mus embryo ganglieblockerande höjd.
Transcript
Syftet med denna video protokoll är att upprätta en källa och effektivt protokoll för embryonal mus neuralstamcell isolering och kultur. Hej, jag är Maryam Sadeghi-Zadeh. Jag är masterstudent i cell- och molekylärbiologi i Royan-institutet.
Idag vill jag och min kollega visa dig hur man skördar neural stamcell från 13 embryomus ganglionic eminens. Hej, jag är Bahareh Alizadeh-Shoorjestan. Jag är masterstudent för cell- och molekylärbiologi i stamcellsavdelningen vid Royan Institute for Biotechnology.
Hej, jag är Reza Dehghani-Varnamkhasti. Även jag studerar Cell- och molekylärbiologi i Royan Institute. Kirurgiska ingrepp inkluderar skörd varje 13 mus embryon från livmodern.
Skära framsidan av fontanel av embryo med en böjd nål spets extrahera hjärnan från skallen. Mikro-dissektion av isolerade hjärnan att skörda den ganglionic eminens. Dissociation av den skördade vävnaden i ett neuralt stamcellsmedium för att få en enda cell suspension.
Och slutligen, plätering celler i en suspension kultur för att generera nervceller. Rengör och desinfektionsmedel huden av buken området genom att spraya med 70%etanol. Kontrollera huden uppåt buken och sedan klippa huden och understrukna ansiktsbehandling med sax för att avslöja bukhålan och livmoderhorn.
Avlägsna livmoderhornen som innehåller embryona med en sax och överför dem till ett koniskt rör på 50 ml som innehåller 25 ml kall HEPES MEM-buffert. Placera det koniska röret under laminalflödeshuven. Öppna locket under huven.
Ta ut livmoderhornen från röret och skölj tre gånger med tillräckligt med volym av den färska kalla HEPES MEM-bufferten för att eliminera skräp och blod. Överför livmodervävnaden till en 10 cm petriskål som innehåller 7 till 10 ml kall HEPES MEM-buffert. Öppna livmoderhornen med hjälp av fin sax och överför embryon till en ny rätt som innehåller 7 till 10 ml kall HEPES MEM-buffert.
Nu sätter 10 cm skålen med embryon under dissekera mikroskop för mikroskopoperation. Böj spetsen på en sprutnål genom att trycka dess spets på ett skalpellbladshandtag av stål. Böj nålspetsen tills spetsen är böjd i en vinkel på 70 till 90 grader.
Kontrollera nålspetsen under det dissekerande mikroskopet för att se böjen vid nålspetsen. Naturligtvis embryon har en lateral ställning i detta. Utan att ändra sin position, höll halsen och kroppen av embryot med fina tärningar och sedan för in den böjda delen av nålen djupt in i framsidan av fontanel av embryohuvudet.
Det skulle vara en liten blödning eller en blodpropp där. Flytta nålspetsen ytligt medan den böjda delen är inne i utbuktning mot pannan och sedan mot bakhuvudet. Se till att skära igenom huden och skallen, och inte att skada den underliggande hjärnan.
Tryck huden med nålspetsen i laterled för att avslöja hjärnan. Sätt in nålen från laterala sidan av huden till under ramen från den laterala sidan av huden till området under hjärnan. Och ta sedan bort hjärnan från denna hårbotten genom att trycka den för att komma ut från dissekerade skallen.
Den ganglionic eminens visas tydligt i video med dess mediala och laterala delar. Höll hjärnan stadigt med hjälp av vårdtens tärna och sedan använda mikroscissorer för att skära hjärnhalkens cortex för att exponera den ganglionic eminens. Höll hjärnan och placera dissekeras ganglionic eminens i 15 ml centrifug röret som innehåller neurala stamcellsmedia.
Upprepa detta förfarande tills alla hjärnan har mikro-dissekeras. Skär dissekeras ganglionic eminens genom att placera pipetten spets mot botten av röret och pipetter suspensionen upp och ner för 2 5 gånger för att bryta upp vävnaden för att få en enda cell suspension. Centrifugera suspensionen vid 110 g i 5 minuter.
Ta bort supernatanten och resuspend cellerna i 1 ml 0,05%-tub i EDTA. Inkubera cellen suspension i en 37 grader Celsius i 10 minuter. Och sedan lägga till en motsvarande volym sojabönor trypsin inhibitor för att stoppa trypsin aktivitet.
Pipettera cellupphängningen upp och ner för att se till att trypsin har varit helt inaktiverad. Centrifugera cellupphängningen vid 110 g i 5 minuter. Ta bort supernatanten och resuspend cellerna i 1 ml komplett neurala stamceller medium och räkna antalet celler.
Platta cellerna på neurala stamceller medium i lämplig storlek vävnad kulturodling kolv. Överför 5 ml 2T25, 20 ml till T75, och 40 ml till T175 kolvar. Neurospheres kommer att visas efter 3 dagar kultur vid 37 grader Celsius i en befuktad inkubator med 5%CO2.
Att suga kultur neurosfärerna, överföra mediet med suspenderade neurospheres till centrifug till centrifug vid 110 g i 5 minuter, och sedan kassera supernatant. Vid 1 ml av 0,05%trypsin EDTA och inkubera på 37 grader Celsius i 10 minuter. Inaktivera sedan trypsin med hjälp av sojaben tyrpsinhämmare och pipetter neurosfärerna försiktigt upp och ner för att göra dem enstaka celler.
Centrifugera cellupphängningen vid 110 g i 5 minuter. Kassera supernatanten och resuspend cellerna i 1 ml av neurala stamceller medium. Dessa celler är redo för nästa steg kultur eller kultur på laminat och helt belagd yta för avancerade experiment.
Genom att odla en miljon primära neurala stamceller efter sju dagar antalet celler kommer att öka till tre till fyra miljoner. Efter sex till sju dagar sfärerna bör mäta mellan 150 till 200 mikrometer i diameter och kommer att vara redo för sub kultur på laminat poly ornitin belagda rätter i avsaknad av bFGF och EGF för neuronal differentiering. Flow cytometry analysresultat visar att nära 95%av celler som utgör neurosfärerna var Nestin positiva vilket är en känd markör för neurala stamceller.
Analyser med hjälp av beta tubulin III och ganglio fibrösa protein antikroppar avslöjar att genom att odla neurala stamceller på belagda ytan runt 94%visas neuronal fenotyp och runt 5%visa gliamokulatiska fenotyp. I just denna korta video ett labb teknik för snabb isolering av neural stamcell från 13 mus embryo ganglionic eminens. Jag hoppas att du kommer att bli framgång i din neurala stamcellskultur.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
