Medicine
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Candida एल्बीकांस के जैव-ऊर्जा विज्ञान जांच वास्तविक समय Extracellular फ्लक्स विश्लेषण का उपयोग
Chapters
Summary March 19th, 2019
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यहाँ, हम एक अतिरिक्त फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर candida एल्बिकैंस में mitochondrial श्वसन और glycolytic समारोह की जांच करने के लिए एक पदश: प्रोटोकॉल मौजूद.
Transcript
कैंडिडा एल्बिकान में ग्लाइकोलिटिक फंक्शन और माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन का निर्धारण करने के लिए यह प्रोटोकॉल महत्वपूर्ण है। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि यह कैंडिडा एल्बिकान से माइटोकॉन्ड्रिया को शुद्ध करने की आवश्यकता के बिना माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को मापा जा सकता है। कैंडिडा एल्बिकान या अन्य फंगल रोगजनकों में माइटोकॉन्ड्रियल और ग्लाइकोलिटिक रास्तों पर आनुवंशिक हेरफेर या रासायनिक मॉड्यूलर के प्रभावों की जांच करने के लिए इस विधि को अनुकूलित किया जा सकता है।
यह तकनीक अपेक्षाकृत सरल है। या जीव के आधार पर, उनका उपयोग कोशिका संख्या और उनकी परख में माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों की एकाग्रता को अनुकूलित करने में मदद कर सकता है। एक लैमिनार फ्लो हुड में, ऊतक ग्रिड पानी में पॉली-डी-लाइसिन को 50 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर की अंतिम एकाग्रता में भंग करें।
समाधान को अच्छी तरह से मिलाएं और इसे 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूबों में डालें जिससे कम से कम 1.3 मिलीलीटर प्रति ट्यूब होना सुनिश्चित हो। परख प्लेट के प्रत्येक कुएं में इस मिश्रण के 50 माइक्रोलीटर जोड़ें, ढक्कन को कवर करें और कमरे के तापमान पर एक से दो घंटे तक इनक्यूबेट करें। फिर समाधान को एस्पिरेट करें।
परख प्लेट के कुओं को एक बार बाँझ ऊतक संस्कृति ग्रेड पानी के ५०० माइक्रोलीटर के साथ कुल्ला, ढक्कन खोलने के लिए और कुओं हवा सूखी करने के लिए अनुमति देते हैं । यदि प्लेट का उपयोग उस दिन तैयार नहीं किया जाता है, तो इसे अधिकतम दो से तीन दिनों के लिए चार डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। प्रयोग से एक दिन पहले, अतिरिक्त प्रवाह परख किट खोलें और सामग्री को हटा दें।
सेंसर कारतूस को यूटिलिटी प्लेट के बगल में उल्टा रखें। कैलिब्रेंट के एक मिलीलीटर के साथ उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं को भरें और फिर सेंसर कारतूस वापस रखें। सुनिश्चित करें कि फ्लोरोफोरस वाले सेंसर कैलिब्रेंट में डूबे हुए हैं।
रात भर एक गैर कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में ३७ डिग्री सेल्सियस पर सेंसर कारतूस इनक्यूबेट । परख से एक दिन पहले, YPD शोरबा में तैयार सी एल्बिकान टीका और २०० आरपीएम पर एक शेखर में 30 डिग्री सेल्सियस पर रात भर बढ़ जाना । परख के दिन, परख माध्यम में कोशिकाओं की एक उपयुक्त संख्या को पतला करने के लिए १००, 000 कोशिकाओं प्रति १०० माइक्रोलीटर की अंतिम एकाग्रता उपज ।
कुओं A1, B4, C3, और D6 को छोड़कर परख प्लेट के प्रत्येक कुएं में पतला कोशिकाओं के १०० माइक्रोलीटर जोड़ें । इन कुओं में, पृष्ठभूमि सुधार के लिए परख माध्यम के केवल 100 माइक्रोलीटर जोड़ें। 60 मिनट के लिए एक गैर कार्बन डाइऑक्साइड इनक्यूबेटर में 37 डिग्री सेल्सियस पर थाली इनक्यूबेट करने के लिए कोशिकाओं को थाली की सतह का पालन करते हैं। पाठ प्रोटोकॉल में उल्लिखित इसी परख माध्यम में 10X एकाग्रता पर माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन परख के लिए यौगिकों को तैयार करें।
पोर्ट ए में शम के 50 माइक्रोलीटर, पोर्ट बी में ओलिगोमाइसिन के 50 माइक्रोलीटर, पोर्ट सी में पोटेशियम सायनाइड के 62 माइक्रोलीटर, और एंटीमाइसिन ए के 68 माइक्रोलीटर पोर्ट डी नेक्स्ट में जोड़ें, टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित माध्यम में 10X एकाग्रता में ग्लाइकोलिटिक तनाव के लिए यौगिक तैयार करें। पोर्ट ए में ग्लूकोज के 50 माइक्रोलीटर, पोर्ट बी में ओलिगोमाइसिन के 55 माइक्रोलीटर, पोर्ट सी में 2-डीजी के 62 माइक्रोलीटर, और एंटीमाइसिन ए के 68 माइक्रोलीटर को परख से पहले पोर्ट डी में जोड़ें, अतिरिक्त फ्लक्स एनालाइजर खोलें और परख जादूगर टैब का उपयोग करके परख टेम्पलेट स्थापित करें। चरण-दर-कदम निर्देशों का पालन करें और सेटअप के दौरान पॉप आउट होने वाली सभी जानकारी भरें।
एक समूह लेआउट उत्पन्न करें और टेक्स्ट प्रोटोकॉल में उल्लिखित प्रोटोकॉल स्थापित करें। परख से पहले इन लेआउट को सहेजें। परख के समय, परख जादूगर टैब में खुली फ़ाइल विकल्प में इसी फ़ाइल को खोलकर सहेजे गए प्रोटोकॉल को बहाल करें।
फिर कैलिब्रेंट युक्त हाइड्रेटेड सेंसर कारतूस के संबंधित बंदरगाहों में 10X यौगिकों लोड। अतिरिक्त प्रवाह विश्लेषक के वाहक ट्रे में सेंसर कारतूस लोड करें। स्क्रीन पर स्टार्ट बटन पर क्लिक करके अंशांकन शुरू करें।
इसके बाद, धीरे-धीरे 450 माइक्रोलीटर के लिए अंतिम मात्रा लाने सेल अशांति को कम करने के लिए दीवारों के किनारे सेल प्लेट के लिए परख माध्यम के 350 माइक्रोलीटर जोड़ें। परख प्लेट के साथ अंशांकन युक्त उपयोगिता प्लेट को बदलें और परख जारी रखें। परख पूरी हो जाने के बाद सेंसर कारतूस और प्लेट निकाल लें।
फाइल को उपयुक्त गंतव्य फ़ोल्डर में सहेजें। इस अध्ययन में सी एल्बिकान के बायो एनर्जेटिक कार्यों का आकलन एक्स्ट्रा फ्लक्स एनालाइजर से किया जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन mam33 की कमी वाले उत्परिवर्ती को ऑक्सीजन खपत दर और बाह्य कोशिकीय अम्लीकरण दरों पर माइटोकॉन्ड्रियल प्रोटीन के विलोपन के प्रभावों का अध्ययन करने के लिए इसके पूरक तनाव के साथ भी शामिल किया गया है।
सी एल्बिकान जंगली प्रकार प्रति मिनट 145 पिकोमोल्स की ऑक्सीजन खपत दर दिखाता है जो किसी भी बाह्य प्रवाह परख के लिए इष्टतम सीमा के भीतर अच्छी तरह से है। जंगली प्रकार की बेसल ऑक्सीजन खपत दर, mam33 उत्परिवर्ती और mam33 पूरित उपभेदों कोई अंतर नहीं दिखा । इसी तरह, उपभेदों के बीच बेसल एक्स्ट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन दरों में कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं देखा जाता है।
हालांकि, पोटेशियम सायनाइड, जंगली प्रकार और mam33 उत्परिवर्ती के साथ जटिल-IV को बाधित करके, mam33 पूरित उपभेदों ग्लाइकोलिसिस की ओर एक महत्वपूर्ण बदलाव दिखाते हैं। Mam33 उत्परिवर्ती तनाव हालांकि एक प्रतिपूरक ग्लायोटिक बदलाव दिखाने में विफल रहा है सुझाव है कि यौगिक-चतुर्थ निर्भर मार्ग इस तनाव में बिगड़ा हुआ है । ग्लाइटोलिटिक स्ट्रेस टेस्ट में कोशिकाओं को ग्लूकोज से एक घंटे तक भूखा रखा जाता है और बेसल ऑक्सीजन खपत दर और एक्स्ट्रासेलुलर एसिडिफिकेशन रेट को मापा जाता है।
भुखमरी पर, mam33 उत्परिवर्ती तनाव अन्य उपभेदों की तुलना में काफी कम ऑक्सीजन की खपत और बाहेल अम्लीकरण दरों को दिखाता है। यह श्वसन और ग्लाइटोलिसिस दोनों के लिए ग्लूकोज के बिगड़ा उपयोग का सुझाव देता है जब कोशिकाओं को भुखमरी की स्थिति के लिए मजबूर किया जाता है। ग्लूकोज इंजेक्शन के बाद, सभी उपभेदों उनके ऑक्सीजन की खपत दर और बाह्राश एसिडिफिकेशन दर दोनों की उत्तेजना दिखाते हैं ।
परख प्लेट की कोटिंग कैंडिडा एल्बिकान कोशिकाओं को प्लेट का पालन करने की अनुमति देती है। कैंडिडा एल्बिकान कोशिकाओं का अनुचित पालन परख परिणाम को प्रभावित करेगा। इस तकनीक के विकास के बाद, इसे कोशिका प्रकारों और बीमारियों की एक विस्तृत श्रृंखला में नियोजित किया गया है जो शारीरिक और रोग स्थितियों के दौरान माइटोकॉन्ड्रिया कैसे कार्य करते हैं।
उदाहरण के लिए, इस परख में रोगी-व्युत्पन्न और नियंत्रण कोशिकाओं को नियोजित करना, माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन को कैसे बदला जाता है, इसके विशिष्ट प्रश्नों का समाधान करना संभव है। पोटेशियम सायनाइड और एंटीमाइसिन ए जैसे माइटोकॉन्ड्रियल अवरोधकों को तैयार करते समय देखभाल की जानी चाहिए क्योंकि ये यौगिक बेहद जहरीले होते हैं।
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