Cancer Research
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Summary January 20th, 2019
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在这里, 我们提出了一个详细的协议, 修改酶图技术, 其中荧光肽被用作可降解的底物, 而不是原生蛋白质。生物样品在荧光肽酶谱中的电泳使检测到比以前的酶学技术更广泛的蛋白酶。
Transcript
目前的酶学技术检测出数量有限的蛋白酶。荧光肽酶学使用荧光肽作为可降解基质，从而能够测量更大范围的蛋白酶。这种方法的主要优点是模块化设计。
荧光肽的序列决定了检测到哪些蛋白酶，荧光肽可以很容易地与不同序列的肽交换，即检测其他蛋白酶的能力。该技术有助于为肽在工程生物材料（如用于药物输送或组织工程应用）中作为可降解交链剂的用途提供信息。将这种肽加入这种技术可以识别导致生物材料降解的组织分泌蛋白酶。
演示此技术对于可视化与其他酶成像技术相比独一无二的多层方法非常重要。展示这种技术将是，阿梅亚德什穆赫，一个研究生从我的实验室。首先，准备一个10%聚丙烯酰胺解凝胶溶液，如文本协议表之一所述。
在浇注凝胶之前，立即加入TEMED和PS。然后，用分解凝胶溶液填充并空空 1.5 毫米迷你凝胶盒。在聚丙烯酰胺凝胶的顶部加入一层薄薄的异丙醇，以产生水平凝胶并防止气泡。
使用剩余的聚丙烯酰胺溶液跟踪聚合反应的进度。当管中的聚丙烯酰胺完全凝固时，反应是完整的。当第一个分解析凝胶层聚合时，从20摄氏度的储存中取回Azido-PEG3-Maleimide试剂盒，使组件达到室温。
然后，溶解小瓶2的组件在制造商推荐的DMSO体积。和涡流30秒，以确保液体是良好的混合。将小瓶中的内容转移到一个干净、干燥的 100 毫升圆形底瓶中，其中含有搅拌棒。
立即插入一个橡胶隔膜塞，用隔膜，用注射器刺穿到烧瓶口。接下来，将两根 18 规格的注射器针头插入隔膜。将其中一根注射器针头连接到惰性油箱，让气体在圆底烧瓶中加注三分钟。
然后，关闭惰性气体，将其从针头中分离出来。使用注射器将小瓶二的全部内容注入烧瓶中。取出针头和注射器。
在搅拌时，让部件在室温下混合 30 分钟。在此之后，拆下橡胶隔膜塞，将内装物转移到干净的五毫升离心管中。一旦第一个分子凝胶层聚合，就从异丙醇层中倾泻而下。
将一毫升去离子水放在凝胶上，然后倒出水冲洗凝胶。从80摄氏度的储存中检索硫醇功能化荧光肽。允许在室温下解冻。
准备含有Azido-PEG3-Maleimide链接剂分子和荧光肽的10%解孔凝胶溶液，如文本协议表之一所述。在浇注凝胶之前，立即添加 TMED 和 APS。接下来，用肽溶液填充凝胶盒剩余部分的一半。
在聚丙烯酰胺凝胶的顶部加入一层薄薄的异丙醇，以产生水平凝胶并防止气泡。使用剩余的聚丙烯酰胺溶液跟踪聚合反应的进度。反应完成后，倒出异丙醇层。
将一毫升去离子水放在凝胶上，然后倒出水冲洗凝胶。如果不立即使用凝胶，请将它们浸入一个塑料盒中，在摄氏四度时装满 100 毫升 1x PBS。用铝箔包裹盒子，防止光漂白。
首先，准备一个5%堆叠凝胶溶液，如表之一的文本协议中所述。在浇注凝胶之前，立即添加 TMED 和 APS。用堆叠凝胶溶液填充凝胶盒的剩余空部分。
快速将 1.5 毫米凝胶梳插入堆叠凝胶层，确保井下没有气泡。使用剩余的聚丙烯酰胺溶液跟踪聚合反应的进度。当反应完成后，轻轻地从凝胶盒背面取下梳子和胶带。
首先，将样品溶解在传统的酶学样品缓冲液中。向凝胶设备添加 400 毫升 os 1X 三糖烯 SDS 运行缓冲液。每井最多装载 35 微升样品。
在4摄氏度下以120伏度运行样品一个半小时，或直到分子量标准表明感兴趣的蛋白酶在肽解析凝胶层内。在此之后，从塑料盒中取下凝胶。在温和搅拌下，在室温下将凝胶在室温下重新洗涤缓冲液中清洗三次。
每次洗涤，持续10分钟。将凝胶转移到开发中的缓冲液中 15 分钟。然后用新鲜发育的缓冲液代替溶液，在37摄氏度的温和搅拌下孵育24小时。
之后，使用荧光凝胶扫描仪成像器与适当的激励和发射过滤器来成像凝胶。在这项研究中，将荧光蛋白酶可降解肽纳入聚丙烯酰胺凝胶中。QGIW 是一种胶原蛋白，用于检测细胞合发生，而 LACW 是一个针对 MMP-14 和 MMP-11 的检测进行了优化的序列。
荧光成像揭示了LACW肽凝胶中的多个波段，而在QGIW凝胶中只看到一个波段。与明胶酶学相比，LACW凝胶能够检测出更多的蛋白糖解带，这证明肽酶学能够检测比使用原生基质的传统方法在生物样品中存在的更广泛的蛋白酶。然后，肽酶造影细胞在含有GM6001（广谱MMP抑制剂）或E64（一般导管素抑制剂）的发育缓冲液中孵育。
使用 GM6001 治疗 LACW 肽凝胶，可降低带状强度。而E64的治疗没有明显的效果。使用 GM6001 处理 QGIQ 肽凝胶可完全消融以前看到的带子。
而 E64 则不起作用。明胶酶造影使用纯化、活性的MMP-9进行，将肽酶学的敏感性与当前金标准进行比较。LACW凝胶能够检测MMP-9的最小浓度。
蛋白酶需要特定的条件才能重新自然并被激活。仔细准备缓冲液，以确保成分和 PH 正确。此方法可以辅之以现有的技术，以验证身份，并执行测量蛋白酶的进一步分析。
这包括西方印迹、实时 PCR 和质谱。处理聚丙烯酰胺时要小心。非多边化溶液被认为是一种有效的神经毒素，在处理时应始终佩戴适当的个人防护设备。
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