Journal
/
/
Identifiering av mediatorer av T-cells Receptor signalering via Screening av kemiska hämmare bibliotek
JoVE Journal
Immunology and Infection
This content is Free Access.
JoVE Journal Immunology and Infection
Identification of Mediators of T-cell Receptor Signaling via the Screening of Chemical Inhibitor Libraries

Identifiering av mediatorer av T-cells Receptor signalering via Screening av kemiska hämmare bibliotek

8,872 Views

08:49 min

January 22, 2019

DOI:

08:49 min
January 22, 2019

3 Views
, , , ,

Transcript

Automatically generated

Vår hög genomströmning assay lägger till de tillgängliga metoderna för identifiering av små molekyler och deras mål som modulerar TCR signalering och T-cells aktivering. Vår analys har en själv-korrigerande aspekt genom att filtrera bort giftiga föreningar och identifiera hämmare av TCR signalering och stimulering-inducerad apoptos. Identifiering av medlare av TCR signalering kan stöd i utvecklingen av terapi för immunsjukdomar.

Vi gav en stark stimulans för thymocytes härrör från TCR-polyklonala möss. Det är möjligt att använda TCR-transgena möss och stimulera dem med andra peptid ligand tetramerer för svagare stimulering. Denna analys innebär användning av små volymer och av små volymer plattor för odling av cellerna.

Detta nödvändiggör noggrann hantering av plattorna och dess innehåll. Det finns många föreningar i biblioteket av kinashämmare som anses farliga. För säkerhetshänsyn, behandla alla föreningar som lika farliga, och följ leverantörens rekommenderade säkerhetsåtgärder.

För att påbörja behandlingen av tymocyter med kinashämmare, använd en flerkanalspipett för att lägga till 40 mikroliter per brunn av tymocyter till en liten volymplatta. Lägg tallriken på is. Sedan pipettera en del av kinashämmare, DMSO, och dexametason, och fyra delar av den kompletta RPMI media i en 96-brunnsplatta.

Utse åtta brunnar av plattan med liten volym till obehandlade kontroller, fyra brunnar till dexametasonbehandlade positiva kontroller för celldöd genom att lägga till det utspädda dexametasonen vid femmikarkoncentrationen, och fyra brunnar till fordonsbehandlade kontroller, genom att lägga till 0,5 mikroliter av den utspädda DMSO. Därefter, från motsvarande brunnar av inhibitorplattan, tillsätt 0,5 mikroliter av varje utspädd hämmare till 96-brunnsplattan. Till att börja tymocyte stimulering, först se till att anti-CD-3 och CD-28 pärlor är enhetligt åter upphängd.

Därefter tvätta en milliliter av pärlorna med två milliliter av PBS-bufferten. Sätt röret på ett magnetiskt stativ för att separera pärlor från supernatant och aspirera lösningen. Sedan åter avbryta pärlorna i en milliliter av den kompletta RPMI medium.

Tillsätt 10 mikroliter per brunn av pärlfjädringen till varje inhibitorbehandlat prov, de fyra DMSO-behandlade proverna, och fyra av de åtta obehandlade proverna. Lägg till 10 mikroliter av den kompletta RPMI till de återstående fyra obehandlade brunnarna. Använd en mikroplatt orbital shaker att försiktigt agitera plattan.

Därefter inkubera tymocyterna i 37 grader Celsius och 5%koldioxid miljö i 17 till 20 timmar, eller över natten. Prime en automatiserad laminär flödesplatta bricka, först med 150 milliliter av etanol Tween lösning, sedan med avjoniserat vatten kompletterat med 1%Tween 20, och slutligen, med FACS tvätt buffert. Vid slutet av inkubationen med hjälp av plattan bricksystemet, tvätta plattan med FACS tvätt buffert med hjälp av en nio gånger tvättcykel.

Varje tvätt lägger till och tar bort 55 mikroliter av tvättbuffert genom laminärflöde, vilket resulterar i en exponentiell utspädning av reagenserna i brunnarna. För att fläcka ytantigener, späd först en enhetsvolym av anti-CD-3, anti-CD-4, anti-CD-8 och anti-CD-69-antikroppar i 100-enhetsvolymer av FACS-tvättbufferten. Sedan åter avbryta cellerna i 25 mikroliter av färgning antikroppsblandningen.

Använd en mikroplatta orbital shaker att försiktigt agitera plattan, och sedan lämna plattan på is i 30 minuter. För att fixa cellerna, tvätta först plattan med 55 mikroliter AV FACS tvättbuffert med nio gånger tvättcykel som beskrivits tidigare. Lägg sedan till 50 mikroliter av fixering-impermeabliseringsbufferten till varje brunn.

Blanda väl och inkubera plattan på is i 30 minuter. Efter inkubationen, preparera en perm perm med ett X och tvättbuffert genom att späda 25 milliliter av det medföljande 10X-lagret i 225 milliliter Ultrapure vatten. Prime plattan bricka med en-X buffert och tvätta plattan med 55 mikroliter av en-X buffert med hjälp av en nio gånger tvättcykel som beskrivs tidigare.

Till att börja med, blanda en milliliter av antispase 3 antikroppen med två milliliter av en-X perm och tvätt buffert. Tillsätt 25 mikroliter per brunn av blandningen till de fasta cellerna. Använd en mikroplatt orbital shaker att försiktigt agitera plattan.

Lämna plattan på is i en timme. Vid slutet av inkubationen upprepas tvättsteget nio gånger med en-X perm och tvättbuffert. Tillsätt sedan 25 mikroliter av FACS tvättbuffert till alla brunnar av plattan.

Pipett upp och ner några gånger för att blanda lösningen. Slutligen, överför de blandade proverna till mikrotiterrör. Fylla på rören med FACS tvättbuffert till en total volym på 200 mikroliter, och fortsätt till flödescytometrianalysen.

Efter anti-CD-3, CD-28 stimulering, en ökning av kaspas-3 aktivering och TCR nedreglering observerades i både den obehandlade och DMSO mock-behandlade prover. Också, en ökning av CD-69 uttryck observerades i båda stimulerade prover. De dexametason-behandlade prov visade en ökning av kaspas-3 aktivering oberoende av CD-69 uppreglering, som förväntat för den oberoende apoptos-inducerande effekten och TCR stimulering.

Den selektiva försämringen av T-cells aktiveringsfenomen visades av olika inhibitorer som antingen undertryckt både caspase-3 aktivering och CD-69 upp-reglering, eller hämmade CD-69 upp-reglering, men inte försämrar caspase-3 aktivering. Det fanns också hämmare som inte riktade en relevant kinas av TCR-signalering väg, och därför inte undertrycka både CD-69 uppreglering och caspase-3 aktivering. Skärmen resultatet av staurosporine, den apoptos-positiva kontroll, visade höga nivåer av kaspas-3 aktivering, som förväntat.

Resultatet visade dock också låga nivåer av CD-69 uttryck som kan hänföras till antingen dess medierad hämning av protein kinase C eller dess inducerad apoptos innan CD-69 uttryck. Jämförelse av olika analys protokoll visade inga skillnader i aktiv caspase-3, CD-69 och TCR färgning av den negativa kontrollen, den positiva kontrollen för celldöd, fordonet kontroll och en inhibitor-behandlade prov. Förinkubationsstadier är avsedda att underlätta användningen av den lilla volymen plattan för odling av cellerna.

Det standardberoende centrifugeringsberoende protokollet tillhandahålls också i manuskriptet. Potentiellt intressanta hämmare eller mål kan valideras med hjälp av olika celltyper och även i olika arter, såsom pagopheral muslymfocyter eller mänskliga primärceller. Efterföljande karakterisering av de identifierade molekylerna och målen kan bidra till att förbättra förståelsen av T-cellbiologi och expandera på möjliga mål för immunmodulering.

Summary

Automatically generated

Detta dokument använder en flow-flödescytometri-baserad analys till skärmen bibliotek av kemiska hämmare för identifiering av hämmare och sina mål som påverkar T-cells receptor signalering. Metoderna som beskrivs här kan också utökas för hög genomströmning filmvisningar.

Read Article