Login processing...

JoVE Journal
Neuroscience

This content is Open Access.

JoVE Journal Neuroscience

Primær cellekultur af renset GABAergic eller Glutamatergic neuroner etableret gennem fluorescens-aktiveret celle sortering

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

Journal (Neuroscience)

Co-analysis of Brain Structure and Function using fMRI and Diffusion-weighted Imaging

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Journal (Neuroscience)

Ex Vivo Oculomotor Slice Culture from Embryonic GFP-Expressing Mice for Time-Lapse Imaging of Oculomotor Nerve Outgrowth

Click here for the English version

Primær cellekultur af renset GABAergic eller Glutamatergic neuroner etableret gennem fluorescens-aktiveret celle sortering

Article DOI: 10.3791/58974-v

June 6th, 2019 •

Paul Turko¹, Keenan Groberman¹, Toralf Kaiser², Yuchio Yanagawa³, Imre Vida¹

¹Institut für Integrative Neuroanatomie, Charité, Universitätsmedizin Berlin, ²Department for Cytometry and Cellsorting, German Rheumatism Research Center, Leibniz Institute, ³Departments of Genetic and Behavioral Neuroscience, Graduate School of Medicine, Gunma University

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

June 6th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Denne protokol beskriver en celle sortering baseret metode til rensning og kultur af fluorescerende GABAergic eller glutamatergic neuroner fra neocortex og hippocampus af postnatale mus eller rotter.

Transcript

Denne protokol beskriver en enkel og reproducerbar metode til rensning og dyrkning af specifikke typer af primær neuron. Disse kulturer er velegnede til elektrofysiologisk, morfologisk og overlevelsesanalyse. Kulturer af renset neuroner kan bruges til at studere fundamentals af neuronal fysiologi, dannelse af synapser samt hvordan neuronal netværk udvikler sig.

Mens vi fokuserer på kortikale glutamatergic vigtigste celler og GABAergic interneurons, denne procedure kan let ændres for at studere eventuelle neuronal linjer udtrykke fluorescerende proteiner. For at forberede glasdæksler, først tø en fem milliliter aliquot af 200 mikrogram pr milliliter PLL opløsning. Denne stamopløsning fortyndes til 20 mikrogram pr. milliliter ved at tilsætte 45 milliliter rent sprøjtevand.

Derefter filtreres opløsningen i et nyt 50 milliliter konisk rør og mærke dette rør som PLL steril. Dernæst skal du placere 100 sterile runde 12 millimeter glasdæksler i den sterile PLL-opløsning. Rør røret omrøres hvert femte til 10 minutter i to til tre minutter for at sikre jævn belægning.

Efter 40 minutters PLL belægning, tage to stykker silkepapir og læg dem fladt i flowskabet. Steriliser papiret ved hjælp af 70% ethanol derefter flade at fjerne folder og lad det tørre. Efter belægning glasset coverslips i en time med PLL, fjerne overskydende PLL opløsning og tilsæt sterilt injektion grade vand.

Ryst forsigtigt dækslerne i to til tre sekunder for at fjerne overskydende PLL. Gentag dette skylletrin to gange mere. Fjern overskydende vand og derefter overføre coverslips til sterile silkepapir.

Når tør, overføre coverslips til en 24 godt kultur plade. For at forberede cellekulturløsningerne måles 12 milliliter cellekulturbuffer til et 15 milliliter konisk rør og etiket som BSA. Mål fem milliliter cellekulturbuffer til et andet 15 milliliterrør og etiket som papain.

Derefter inkubere begge rør i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Tilføj 120 milligram BSA til røret mærket BSA. Derefter vendes røret for at hjælpe med at opløse opløsningen.

Derefter tilføjes syv milligram papain til røret mærket papain. Retur begge rør til vandbad i 15 minutter. BSA-opløsningen steriliseres i et frisk konisk rør.

Opdel den sterile BSA-opløsning i tre rør, og mærke hvert rør som BSA sterilt og enten et, to eller tre. Nu filtrere sterilisere papain rør og mærke røret som papain steril. Retur alle rørene tilbage til vandbadet og fortsætte med at inkubere ved 37 grader Celsius indtil brug.

For at forberede sig til væv dissektion, lægge ud skalpel, saks, scer og spatel kræves for dissektion af hippocampus og cortex. Placer to 35 millimeter petriskåle og en 100 millimeter petriskål med sterilt filterpapir i strømskabet. Indsamle transgene NexCre; Ai9 eller vesicular GABA transporter Venus mus hvalpe, der skal dissekeres ved hjælp af en fluorescerende lampe med passende excitation og emissionsfiltre til at diskriminere fluorescerende hvalpe fra vilde type liter hjælpere.

Umiddelbart før dissekere dyrene, udfylde hver petriskål med kølet steril cellekultur buffer. Efter dissektion overføres den transgene hvalps hjerne forsigtigt til et sterilt filterpapir. Først dissekere væk lillehjernen og adskille de to halvkugler.

Derefter forsigtigt adskille hippocampus og cortex fra hver halvkugle. Overfør det dissekerede væv til en 35 millimeter petriskål, der indeholder kølet cellekulturbuffer. Derefter overføre de dissekerede hippocampus og cortex til låget af en anden 35 millimeter petriskål.

Brug den flade kant af en skalpel klinge, omhyggeligt hugge vævet i en krydsbevægelse bevægelse, indtil kun små stykker tilbage. Dernæst overføre det hakkede væv med en lille mængde papainopløsning fra petriskålen låget til det sterile papainrør. Inkuber vævet ved 37 grader Celsius i 25 minutter.

Efter papain inkubation overføres det sterile papainrør og sterile BSA-rør til strømskabet. Brug derefter en en milliliter Pasteur pipette til kun at overføre korticohippocampal væv fra papainrøret ind i BSA-røret. For at bryde op eventuelle store klumper af væv, triturere vævet flere gange ved hjælp af en milliliter Pasteur pipette.

Efter dette triturate vævet syv gange ved hjælp af en fin spids Pasteur pipette. Efter 30 sekunder overføres en milliliter af den nederste opløsning og væv fra BSA-rør et til BSA-rør to. Triturate vævet i BSA rør to flere gange ved hjælp af en fin spids Pasteur pipette.

Efter trituration overføres en milliliter det nederste væv og opløsning fra BSA-rør et til BSA-rør tre. Triturate vævet i BSA rør tre gange. Efter trituration overføres al opløsning og væv fra rør to og tre til BSA-rør et.

Triturate to til tre gange mere og centrifuge ved 3, 000 gange g i tre minutter. Efter centrifugering fjernes supernatanten forsigtigt fra det pelleterede væv, og cellerne skal resuspenreseres ved hjælp af en P1000-pipette i to milliliter komplet dvale Et lavt fluorescensmedium. Derefter triturere vævet 20 gange for at sikre fuldstændig resuspension af vævsopløsningen.

Efterfølgende filer celle suspension gennem en 30 mikrometer celle sigte i en polystyren prøve rør. Forbered cellesorteringsopsamlingsrør ved at pipetter 300 mikroslitere af komplet dvale Et medie til det krævede antal polypropylenrør. Vælg de relevante excitations- og emissionsfiltre for hver lysstofcelletype, der skal sorteres.

Ophidse Venus protein ved hjælp af 488 nanometer excitation bølgelængde og opdage det udsendte lys gennem 530/40 emission filter sæt. Udsæt TdTomato protein ved hjælp af 531 nanometer excitation bølgelængde og detektere det udsendte lys gennem 575/30 emission filter sæt. For høj renhed, sortere klart mærket fluorescerende celler.

Efter cellesortering overføres de indsamlede celler til to milliliter runde centrifugerør. Derefter centrifuge cellerne på 3, 000 gange g i tre minutter til at danne en celle pellet. Opslæm cellepillerne igen i den nødvendige mængde forvarmt komplet NBA-medium for at opnå en celletæthed på 1.000 celler pr. mikroliter.

For at bekræfte tilstedeværelsen af dissocierede celler skal du kontrollere celleopløsningen under et mikroskop ved hjælp af en 4X eller en 10X objektiv. Før plating cellerne, vortex ved en medium hastighed i to til tre sekunder for at sikre en jævn celle suspension. Efter vortexing, hurtigt pipette 10 mikroliter af cellen suspension til midten af hver coverslip.

Efter en time fodres cellerne med 500 mikroliter af forvarperede komplette NBA-medium og vende tilbage til inkubatoren ved 37 grader Celsius. For at co-kultur de rensede neuroner og gliaceller, passage gliaceller til det nødvendige antal cellekultur skær. Dette gøres ved plating 40, 000 gliaceller i en 500 mikroliter dråbe komplet NBA medium.

Efter en time, overføre glia cellekultur skær til renset neuroner. Fjern overskydende medier fra kulturindsatserne og vend pladerne tilbage til kuvøsen til dyrkning. Efter vellykket sortering, belagt neuroner skal vises rundt i form med en glat membran og bør ses at spare op neuroids efter cirka en time in vitro.

Ved syv dage in vitro, selv om nogle celledød kan være synlige, levedygtige celler bør være til stede i alle kulturbetingelser. Analyse af rensede kulturer afslører, at både glutamatergic og GABAergic neuroner var i stand til at udvide axoner og dendritter fra deres celle organer og bevare evnen til at generere handling potentialer som reaktion på super tærskel depolarizing nuværende injektioner. Især efter rensning, kun GABAergic neuroner modtaget betydelig mængde af spontan synaptisk transmission og glutamatergic neuroner modtaget meget lidt synaptisk transmission i mangel af gliaceller.

Vigtigere, dyrkning renset neuroner med gliaceller forbedrer neuron vækst og overlevelse samt fremme synaptisk transmission i glutamatergic kulturer. Tilstrækkelig polariserende belægning af coverslips og vedligeholdelse af den fysiologiske pH af kulturmediet under hele proceduren er nøglen til at sikre en god kvalitet cellekulturer. Efter denne protokol bør det være muligt at udføre RNA-sekventering og proteinmassespektroskopi på rensede kulturer, således at translationelle og transskriptionelle processer kan undersøges i specifikke neuronale typer.

X

Simple Hit Counter