Neuroscience
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Primær Cell kultur renset GABAergic eller Glutamatergic neurons etablert gjennom fluorescens-aktivert Cell sortering
Chapters
Summary June 6th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokollen beskriver en celle sortering basert metode for rensing og kultur av fluorescerende GABAergic eller glutamatergic neurons fra mektig og hippocampus av postnatal mus eller rotter.
Transcript
Denne protokollen beskriver en enkel og reproduserbar metode for å rense og kultivere bestemte typer primære nevron. Disse kulturene er egnet for elektrofysiologisk, morfologisk og overlevelsesanalyse. Kulturer av rensede nevroner kan brukes til å studere grunnleggende nevronal fysiologi, dannelse av synapser samt hvordan nevronale nettverk utvikler seg.
Mens vi fokuserer på kortikale glutamatergiske hovedceller og GABAergic interneurons, kan denne prosedyren enkelt endres for å studere eventuelle nevronale linjer som uttrykker fluorescerende proteiner. For å forberede glassdeksler, først tine en fem milliliter aliquot på 200 mikrogram per milliliter PLL løsning. Fortynn denne lagerløsningen til 20 mikrogram per milliliter ved å tilsette 45 milliliter rent injeksjonsgradvann.
Deretter filtrere sterilisere løsningen i en ny 50 milliliter konisk rør og merke dette røret som PLL steril. Deretter plasserer du 100 sterile runde 12 millimeter glassdeksler i den sterile PLL-oppløsningen. Rør røret hvert femte til 10 minutt i to til tre minutter for å sikre jevn belegg.
Etter 40 minutter med PLL-belegg, ta to stykker vevpapir og legg dem flatt i strømningskabinettet. Steriliser papiret ved hjelp av 70% etanol og flat deretter for å fjerne bretter og la det tørke. Etter belegg glassdekslene i en time med PLL, fjern overflødig PLL-oppløsning og tilsett sterilt injeksjonsvann.
Rør forsiktig ut dekkslipsene i to til tre sekunder for å fjerne overflødig PLL. Gjenta dette skylletrinnet to ganger til. Fjern overflødig vann og overfør deretter dekkglassene til det sterile vevspapiret.
Når de er tørre, overfør dekkglassene til en 24-brønns kulturplate. For å forberede cellekulturløsningene, mål ut 12 milliliter cellekulturbuffer til et 15 milliliter konisk rør og etikett som BSA. Mål ut fem milliliter cellekulturbuffer til et annet 15 milliliter rør og etikett som papain.
Deretter inkuber begge rørene i 15 minutter ved 37 grader Celsius. Tilsett 120 milligram BSA i røret merket BSA. Inverter deretter røret for å løse opp løsningen.
Deretter legger du til syv milligram papain til røret merket papain. Returner begge rørene til vannbadet i 15 minutter. Filter steriliser BSA-løsningen i et friskt konisk rør.
Del den sterile BSA-oppløsningen i tre rør og merk hvert rør som BSA sterilt og enten en, to eller tre. Nå filtrere sterilisere papain tube og merke røret som papain sterile. Returner alle rørene tilbake til vannbadet og fortsett å inkubere ved 37 grader Celsius til bruk.
For å forberede seg på vevsdisseksjon, legg ut skalpell, saks, tang og slikkepott som kreves for disseksjon av hippocampus og cortex. Legg to 35 millimeter Petri retter og en 100 millimeter Petriskål som inneholder sterilt filterpapir i strømningsskapet. Samle transgen NexCre; Ai9 eller vesicular GABA transportør Venus mus valper som skal dissekeres ved hjelp av en fluorescerende lampe med passende eksitasjon og utslipp filtre for å diskriminere fluorescerende valper fra vill type liter mates.
Umiddelbart før dissekere dyrene, fyll ut hver petriskål med kjølt steril cellekulturbuffer. Etter disseksjon, overfør forsiktig den transgene valpens hjerne til et sterilt filterpapir. Først dissekere bort lillehjernen og skille de to halvkulene.
Deretter forsiktig skille hippocampus og cortex fra hver halvkule. Overfør det dissekerte vevet til en 35 millimeter petriskål som inneholder kjølt cellekulturbuffer. Deretter overfører du den dissekerte hippocampus og cortex til lokket på en annen 35 millimeter petriskål.
Bruk den flate kanten av et skalpellblad, hakk forsiktig vevet i en kryssbevegelse til bare små biter gjenstår. Deretter overfører du det hakkede vevet med en liten mengde papainløsning fra petriskållokket til det sterile papainrøret. Inkuber vevet ved 37 grader Celsius i 25 minutter.
Etter papain inkubasjon, overføre sterile papain rør og sterile BSA rør til strømningskabinettet. Bruk deretter en en milliliter Pasteur pipette for å overføre bare kortikohippocampalvevet fra papainrøret til BSA-røret en. For å bryte opp noen store klumper av vev, triturate vevet flere ganger ved hjelp av en en milliliter Pasteur pipette.
Etter dette, triturate vevet syv ganger ved hjelp av en fin spiss Pasteur pipette. Etter 30 sekunder, overføre en milliliter av den nedre oppløsningen og vev fra BSA rør en til BSA rør to. Triturate vevet i BSA rør to flere ganger ved hjelp av en fin spiss Pasteur pipette.
Etter triturasjon, overføre en milliliter av lavere vev og løsning fra BSA rør en til BSA rør tre. Triturate vevet i BSA rør tre flere ganger. Etter triturasjon, overføre all løsning og vev fra rør to og tre til BSA rør en.
Triturate to til tre ganger og sentrifuge på 3, 000 ganger g i tre minutter. Etter sentrifugering, forsiktig fjerne supernatant fra pelleted vev og resuspend cellene ved hjelp av en P1000 pipette i to milliliter med fullstendig dvale A lav fluorescens medium. Deretter triturate vevet 20 ganger for å sikre fullstendig gjenoppliving av vevsløsningen.
Deretter filerer cellesuspensjonen gjennom en 30 mikrometercelle sil inn i et polystyrenprøverør. Forbered cellesorteringsrør ved å pipetter 300 mikroliter med komplett dvale A-medium til det nødvendige antall polypropylenrørene. For hver fluorescerende celletype som skal sorteres, velger du de riktige eksitasjons- og utslippsfiltrene.
Opphisse Venus protein ved hjelp av 488 nanometer eksitasjon bølgelengde og oppdage det utgitte lyset gjennom 530/40 utslipp filter sett. Opphisse TdTomato protein ved hjelp av 531 nanometer eksitasjon bølgelengde og oppdage det avgitte lyset gjennom 575/30 utslipp filter sett. For høy renhet, sortere sterkt merket fluorescerende celler.
Etter cellesortering overfører du de innsamlede cellene til to milliliter runde bunnsentrigerør. Sentrifuger deretter cellene ved 3000 ganger g i tre minutter for å danne en cellepellet. Gjenoppussette cellepellet i den nødvendige mengden forhåndsoppvarmet komplett NBA medium for å oppnå en celle tetthet på 1000 celler per mikroliter.
For å bekrefte tilstedeværelsen av dissosierte celler, sjekk celleløsningen under et mikroskop ved hjelp av et 4X eller et 10X objektivobjektiv. Før du plating cellene, vortex med middels hastighet i to til tre sekunder for å sikre en jevn celle suspensjon. Etter vortexing, raskt pipette 10 mikroliter av celle suspensjon til midten av hver coverslip.
Etter en time, mate cellene med 500 mikroliter av pre-varmet komplett NBA medium og gå tilbake til inkubatoren på 37 grader Celsius. For å samkulturere de rensede nevronene og glialcellene, passasje glialceller til det nødvendige antall cellekulturinnleggene. Dette gjøres ved å plating 40,000 glial celler i en 500 mikroliter dråpe komplett NBA medium.
Etter en time, overføre glial celle kultur setter inn til rensede nevroner. Fjern overflødige medier fra kulturinnleggene og returner platene til inkubatoren for dyrking. Etter vellykket sortering skal belagte nevroner vises rundt i form med en jevn membran og bør ses for å spare opp nevroider etter ca. en time in vitro.
Ved syv dager in vitro, selv om noen celledød kan være tydelig, levedyktige celler bør være til stede i alle kulturforhold. Analyse av rensede kulturer avslører at både glutamatergic og GABAergic nevroner var i stand til å utvide aksoner og dendritt fra sine cellelegemer og beholde evnen til å generere handlingspotensialer som svar på super terskel depolarizing nåværende injeksjoner. Spesielt etter rensing fikk bare GABAergiske nevroner betydelig mengde spontan synaptisk overføring og glutamatergiske nevroner fikk svært lite synaptisk overføring i fravær av glialceller.
Viktigere, culturing renset nevroner med glial celler forbedrer nevron vekst og overlevelse samt fremme synaptisk overføring i glutamatergic kulturer. Tilstrekkelig polariserende belegg av dekkglassene og opprettholdelse av kulturmedienes fysiologiske pH gjennom hele prosedyren er nøkkelen til å sikre cellekulturer av god kvalitet. Etter denne protokollen bør det være mulig å utføre RNA-sekvensering og proteinmassespektroskopi på rensede kulturer slik at translasjonelle og transkripsjonelle prosesser kan undersøkes i spesifikke nevronale typer.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
