Neuroscience
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फ्लोरेसेंस एक्टिवेटेड सेल सॉर्टिंग के माध्यम से स्थापित शुद्घ गैवाजिक या ग्लूटामैटजिक न्यूरॉन्स की प्राथमिक कोशिका संस्कृति
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Summary June 6th, 2019
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इस प्रोटोकॉल का वर्णन एक कोशिका छंटाई आधारित विधि के शोधन और संस्कृति के लिए फ्लोरोसेंट GABAergic या ग्लूटामैटेजिक ंयूरॉंस से neocortex और बाद में चूहों या चूहों के हिप्पोकैम्पस ।
Transcript
यह प्रोटोकॉल विशिष्ट प्रकार के प्राथमिक न्यूरॉन को शुद्ध और संस्कृति के लिए एक सरल और प्रजनन विधि का वर्णन करता है। ये संस्कृतियां इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल, रूपात्मक और अस्तित्व विश्लेषण के लिए उपयुक्त हैं। शुद्ध न्यूरॉन्स की संस्कृतियों का उपयोग न्यूरोनल फिजियोलॉजी के बुनियादी सिद्धांतों, सिनेप्स के गठन के साथ-साथ न्यूरोनल नेटवर्क कैसे विकसित होता है, का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।
जब हम कॉर्टिकल ग्लूटामेटर्जिक प्रिंसिपल कोशिकाओं और गैबर्जिक इंटरन्यूरॉन्स पर ध्यान केंद्रित करते हैं, तो फ्लोरोसेंट प्रोटीन व्यक्त करने वाली किसी भी न्यूरोनल लाइनों का अध्ययन करने के लिए इस प्रक्रिया को आसानी से संशोधित किया जा सकता है। ग्लास कवर्लिप्स तैयार करने के लिए, सबसे पहले 200 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर पीएलएल समाधान के पांच मिलीलीटर एलिकोट को पिघलाएं। शुद्ध इंजेक्शन ग्रेड पानी के 45 मिलीलीटर जोड़कर 20 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर करने के लिए इस स्टॉक समाधान को पतला करें।
फिर फिल्टर एक नया 50 मिलीलीटर शंकु नली में समाधान बंध्याकरण और PLL बाँझ के रूप में इस ट्यूब लेबल। इसके बाद, बाँझ पीएलएल समाधान में 100 बाँझ दौर 12 मिलीमीटर ग्लास कवरलिप रखें। ट्यूब को दो से तीन मिनट के लिए हर पांच से 10 मिनट में उत्तेजित करें ताकि कोटिंग भी सुनिश्चित की जा सके।
पीएलएल कोटिंग के 40 मिनट के बाद, टिशू पेपर के दो टुकड़े लें और उन्हें प्रवाह कैबिनेट में फ्लैट रखें। 70% इथेनॉल का उपयोग करके पेपर को स्टरलाइज करें फिर क्रीज को हटाने और सूखने के लिए छोड़ने के लिए समतल करें। पीएलएल के साथ एक घंटे के लिए ग्लास कवर्लिप्स को कोटिंग करने के बाद, अतिरिक्त पीएलएल समाधान निकालें और बाँझ इंजेक्शन ग्रेड पानी जोड़ें।
अतिरिक्त पीएलएल को हटाने के लिए दो से तीन सेकंड के लिए कवरस्लिप को धीरे-धीरे उत्तेजित करें। इस रिंसिंग स्टेप को दो बार और दोहराएं। अतिरिक्त पानी निकालें और फिर बाँझ ऊतक कागज के लिए कवर्लिप स्थानांतरित।
एक बार सूखने के बाद, कवरस्लिप को 24 अच्छी तरह से संस्कृति प्लेट में स्थानांतरित करें। सेल कल्चर सॉल्यूशंस तैयार करने के लिए, 15 मिलीलीटर शंकु नली और लेबल को बीएसए के रूप में सेल कल्चर बफर के 12 मिलीलीटर को मापें। एक अलग 15 मिलीलीटर ट्यूब और पैपिन के रूप में लेबल के लिए सेल संस्कृति बफर के पांच मिलीलीटर बाहर उपाय ।
इसके बाद, दोनों ट्यूबों को 15 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। ट्यूब लेबल बीएसए में बीएसए के 120 मिलीग्राम जोड़ें। फिर समाधान को भंग करने में मदद करने के लिए ट्यूब को उलट दें।
इसके बाद पपीन लेबल वाली ट्यूब में सात मिलीग्राम पापीन डालें। 15 मिनट के लिए पानी स्नान करने के लिए दोनों ट्यूबों वापस। फिल्टर बीएसए समाधान को एक ताजा शंकु नली में स्टरलाइज करें।
बाँझ बीएसए समाधान को तीन ट्यूबों में विभाजित करें और प्रत्येक ट्यूब को बीएसए बाँझ और या तो एक, दो या तीन के रूप में लेबल करें। अब फिल्टर पापीन ट्यूब को स्टरलाइज करें और ट्यूब को पैपिन बाँझ के रूप में लेबल करें। सभी ट्यूबों को पानी के स्नान में वापस लौटाएं और उपयोग होने तक 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करते रहें।
ऊतक विच्छेदन के लिए तैयार करने के लिए, हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स के विच्छेदन के लिए आवश्यक स्केलपेल, कैंची, संदंश और स्पैटुला को बाहर रखना। प्रवाह कैबिनेट में बाँझ फिल्टर पेपर युक्त दो 35 मिलीमीटर पेट्री व्यंजन और एक 100 मिलीमीटर पेट्री डिश रखें। ट्रांसजेनिक नेक्सक्रे को इकट्ठा करें; Ai9 या vesicular गाबा ट्रांसपोर्टर वीनस माउस पिल्ले कि उचित उत्तेजन और उत्सर्जन फिल्टर के साथ एक फ्लोरोसेंट दीपक का उपयोग कर विच्छेदित किया जाना है जंगली प्रकार लीटर साथियों से फ्लोरोसेंट पिल्ले भेदभाव करने के लिए ।
जानवरों को विच्छेदन करने से तुरंत पहले, प्रत्येक पेट्री डिश को ठंडा बाँझ सेल कल्चर बफर के साथ भरें। विच्छेदन के बाद, सावधानी से ट्रांसजेनिक पिल्ला के मस्तिष्क को बाँझ फिल्टर पेपर में स्थानांतरित करें। सबसे पहले, सेरिबैलम को अलग करें और दोनों गोलार्द्धों को अलग करें।
फिर ध्यान से हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स को प्रत्येक गोलार्द्ध से अलग करें। विच्छेदित ऊतक को 35 मिलीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें जिसमें ठंडा सेल कल्चर बफर होता है। फिर विच्छेदित हिप्पोकैम्पस और कॉर्टेक्स को एक और 35 मिलीमीटर पेट्री डिश के ढक्कन में स्थानांतरित करें।
स्केलपेल ब्लेड के सपाट किनारे का उपयोग करके, ऊतक को एक क्रिस्क्रॉस गति में सावधानी से काट लें जब तक कि केवल छोटे टुकड़े न रहें। इसके बाद, कटे हुए ऊतक को पेट्री डिश ढक्कन से थोड़ी मात्रा में पापीन समाधान के साथ बाँझ पैपिन ट्यूब में स्थानांतरित करें। ऊतक को 25 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें।
पैपिन इनक्यूबेशन के बाद, बाँझ पापिन ट्यूब और बाँझ बीएसए ट्यूब को प्रवाह कैबिनेट में स्थानांतरित करें। फिर एक मिलीलीटर पाश्चर पिपेट का उपयोग केवल कॉर्टिकोहिप्पोकैम्पल ऊतक को पैपिन ट्यूब से बीएसए ट्यूब वन में स्थानांतरित करने के लिए करें। ऊतक के किसी भी बड़े झुरमुट को तोड़ने के लिए, एक मिलीलीटर पाश्चर पिपेट का उपयोग करके ऊतक को कई बार ट्रिट करें।
इसके बाद, एक बढ़िया टिप पाश्चर पिपेट का उपयोग करके ऊतक को सात बार ट्रिट करें। 30 सेकंड के बाद लोअर सॉल्यूशन और टिश्यू के एक मिलीलीटर को बीएसए ट्यूब वन से बीएसए ट्यूब दो में ट्रांसफर करें। बीएसए ट्यूब में ऊतक को दो बार एक ठीक टिप पाश्चर पिपेट का उपयोग करके ट्रिट करें।
ट्रिट्यूशन के बाद निचले टिश्यू एंड सॉल्यूशन के एक मिलीलीटर को बीएसए ट्यूब वन से बीएसए ट्यूब थ्री में ट्रांसफर करें। बीएसए ट्यूब तीन में टिश्यू को तीन बार ट्राईलेट करें। ट्रिट्यूशन के बाद, सभी समाधान और ऊतकों को ट्यूब दो और तीन से बीएसए ट्यूब एक में स्थानांतरित करें।
तीन मिनट के लिए दो से तीन बार और 3, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र। अपकेंद्रण के बाद, ध्यान से पैलेट ऊतक से सुपरनैट को हटा दें और पूर्ण हाइबरनेट ए कम फ्लोरेसेंस माध्यम के दो मिलीलीटर में P1000 पिपेट का उपयोग करके कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। फिर ऊतक समाधान का पूरा पुनर्पियां सुनिश्चित करने के लिए ऊतक को 20 बार ट्रिट करें।
इसके बाद, 30 माइक्रोमीटर सेल छलनी के माध्यम से सेल निलंबन को पॉलीस्टीरिन नमूना ट्यूब में छलनी करें। पॉलीप्रोपाइलीन ट्यूबों की आवश्यक संख्या के लिए एक मीडिया को पूर्ण हाइबरनेट के 300 माइक्रोलीटर पाइपिंग करके सेल छंटाई संग्रह ट्यूब तैयार करें। प्रत्येक फ्लोरोसेंट सेल प्रकार को हल करने के लिए, उपयुक्त उत्तेजन और उत्सर्जन फिल्टर चुनें।
488 नैनोमीटर उत्तेजन तरंगदैर्ध्य का उपयोग कर वीनस प्रोटीन उत्तेजित करें और 530/40 उत्सर्जन फिल्टर सेट के माध्यम से उत्सर्जित प्रकाश का पता लगाएं। 531 नैनोमीटर उत्तेजन तरंगदैर्ध्य का उपयोग करके उत्तेजित टीडीटोमा प्रोटीन और 575/30 उत्सर्जन फिल्टर सेट के माध्यम से उत्सर्जित प्रकाश का पता लगाएं। उच्च शुद्धता के लिए, चमकीले लेबल फ्लोरोसेंट कोशिकाओं को सॉर्ट करें।
सेल छंटाई के बाद, एकत्र कोशिकाओं को दो मिलीलीटर राउंड बॉटम सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें। फिर कोशिकाओं को सेल पेलेट बनाने के लिए तीन मिनट के लिए 3, 000 बार जी पर अपकेंद्रित्र करें। माइक्रोलीटर प्रति 1, 000 कोशिकाओं के सेल घनत्व को प्राप्त करने के लिए पूर्व-गर्म पूर्ण एनबीए माध्यम की आवश्यक मात्रा में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें।
अलग कोशिकाओं की उपस्थिति की पुष्टि करने के लिए, एक माइक्रोस्कोप के तहत सेल समाधान की जांच एक 4X या एक 10X उद्देश्य लेंस का उपयोग कर । कोशिकाओं को चढ़ाना से पहले, एक भी सेल निलंबन सुनिश्चित करने के लिए दो से तीन सेकंड के लिए एक मध्यम गति से भंवर । भंवर के बाद, प्रत्येक कवरस्लिप के केंद्र में सेल निलंबन के 10 माइक्रोलीटर को जल्दी से पिपेट करें।
एक घंटे के बाद, कोशिकाओं को पूर्व-गर्म पूर्ण एनबीए माध्यम के 500 माइक्रोलीटर के साथ खिलाएं और 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेटर पर लौटें। शुद्ध न्यूरॉन्स और ग्लियल कोशिकाओं को सह-संस्कृति करने के लिए, कोशिका संस्कृति आवेषण की आवश्यक संख्या में ग्लियल कोशिकाओं को पारित करना। यह पूर्ण एनबीए माध्यम की 500 माइक्रोलीटर बूंद में 40, 000 ग्लियल कोशिकाओं को चढ़ाना द्वारा किया जाता है।
एक घंटे के बाद, शुद्ध न्यूरॉन्स के लिए ग्लियल सेल संस्कृति सम्मिलित करें। संस्कृति आवेषण से अतिरिक्त मीडिया निकालें और खेती के लिए इनक्यूबेटर के लिए प्लेटें वापस । सफल छंटाई के बाद, प्लेटेड न्यूरॉन्स को एक चिकनी झिल्ली के साथ आकार में गोल दिखाई देना चाहिए और विट्रो में लगभग एक घंटे के बाद न्यूरोड को अतिरिक्त देखा जाना चाहिए।
विट्रो में सात दिनों तक, हालांकि कुछ सेल मृत्यु स्पष्ट हो सकती है, व्यवहार्य कोशिकाओं को सभी संस्कृति स्थितियों में मौजूद होना चाहिए। शुद्ध संस्कृतियों के विश्लेषण से पता चलता है कि ग्लूटामाएर्जिक और गाबेर्गिक न्यूरॉन्स दोनों अपने सेल निकायों से एक्सॉन और डेंड्राइट्स का विस्तार करने में सक्षम थे और वर्तमान इंजेक्शन को अलग करने की सुपर दहलीज के जवाब में कार्रवाई क्षमता उत्पन्न करने की क्षमता बनाए रखने में सक्षम थे। विशेष रूप से शुद्धिकरण के बाद, केवल गाबेर्गिक न्यूरॉन्स को सहज सिनैप्टिक ट्रांसमिशन की महत्वपूर्ण मात्रा प्राप्त हुई और ग्लूटामेर्गिक न्यूरॉन्स को ग्लियल कोशिकाओं की अनुपस्थिति में बहुत कम सिनैप्टिक ट्रांसमिशन प्राप्त हुआ।
महत्वपूर्ण बात, ग्लियल कोशिकाओं के साथ शुद्ध न्यूरॉन्स को विकसित करने से न्यूरॉन विकास और अस्तित्व में सुधार होता है और साथ ही ग्लूटामेर्गिक संस्कृतियों में सिनैप्टिक ट्रांसमिशन को बढ़ावा मिलता है। कवरस्लिप के पर्याप्त ध्रुवीकरण कोटिंग और प्रक्रिया के दौरान संस्कृति मीडिया के शारीरिक पीएच को बनाए रखने के लिए अच्छी गुणवत्ता सेल संस्कृतियों को सुनिश्चित करने के लिए महत्वपूर्ण हैं । इस प्रोटोकॉल के बाद, अनुवाद और ट्रांसक्रिप्शनल प्रक्रियाओं की विशिष्ट न्यूरोनल प्रकारों में जांच करने की अनुमति देने वाली शुद्ध संस्कृतियों पर आरएनए अनुक्रमण और प्रोटीन मास स्पेक्ट्रोस्कोपी करना संभव होना चाहिए।
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