Immunology and Infection
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स्टैफिलोकोकस ऑरियस संक्रमण के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए एक माउस मॉडल
Chapters
Summary February 28th, 2019
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एक दृष्टिकोण वास्तविक समय का पता लगाने के लिए जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया के लिए वर्णित है त्वचीय घाव और staphylococcus ऑरियस संक्रमण चूहों की. lysm-egfp चूहों की तुलना करके (जो फ्लोरोसेंट न्युट्रोफिल अधिकारी) एक lysm-egfp crossbred immunoकी कमी माउस तनाव के साथ, हम संक्रमण की हमारी समझ अग्रिम और संक्रमण का मुकाबला करने के लिए दृष्टिकोण के विकास.
Transcript
बैक्टीरिया के बोझ और एक न्यूट्रोफिल प्रतिक्रिया की निगरानी करने वाली तकनीकें स्टैफ ऑरियस हठ के तंत्र और उपचार रणनीतियों की प्रभावकारिता में अंतर्दृष्टि प्रदान कर सकती हैं। इस तकनीक का मुख्य लाभ यह है कि संक्रमण की अवधि के दौरान एक लाइव होस्ट में कई मापदंडों को देशांतर रूप से मापा जा सकता है। यह दिखाने के लिए महत्वपूर्ण है कि माउस डोरसम पर घाव को कहां रखा जाए, त्वचा को कैसे उत्पादित किया जाए, और स्टैफ ऑरियस के साथ घाव को कैसे टीका लगाया जाए।
बर्फ पर नकारात्मक 80 डिग्री सेल्सियस भंडारण से ब्याज की बायोल्यूमिनेसेंस स्टैफ ऑरियस तनाव को विगलन करके शुरू करें। एक 5% गोजातीय रक्त आगर प्लेट पर संस्कृति लकीर से पहले । एक रात के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन ।
अगली सुबह, स्टैफ ऑरियस प्लेट से तीन से चार व्यक्तिगत कालोनियों को ट्राइप्टिक सोया शोरबा, या टीएसबी में स्थानांतरित करें। ३७ डिग्री सेल्सियस पर एक रात मिलाते हुए इनक्यूबेशन के लिए क्लोरम्फेनिकोल के 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ पूरक । अगली सुबह, टीएसबी के छह मिलीलीटर में संस्कृति के नमूने के १२० माइक्रोलीटर पतला ।
क्लोरम्फेनिकोल के 10 माइक्रोग्राम प्रति मिलीलीटर के साथ, दो घंटे के लिए ३७ डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेशन, और प्रति मिनट २०० घूर्णन । जब 600 नैनोमीटर पर ऑप्टिकल घनत्व 0.5 तक पहुंच जाता है, तो बैक्टीरियल सस्पेंशन के तीन मिलीलीटर को 10 मिलीलीटर बर्फ-ठंडे डीपीबीएस में स्थानांतरित करें। सुपरनैंट को सावधानीपूर्वक डिकंट करने के बाद, गोली में अतिरिक्त ठंडा डीपीबीएस जोड़ें, और फिर से निलंबित बैक्टीरिया को अच्छी तरह से भंवर करें।
एक दूसरे अपकेंद्रित्र के बाद, बर्फ पर पीबीएस के १.५ मिलीलीटर में बैक्टीरियल गोली को फिर से निलंबित करें । बैक्टीरिया एकाग्रता को सत्यापित करने के लिए, ताजा पीबीएस में 1 x 10 से 4 और 1 x 10 से 5 वीं तक के कारक द्वारा बैक्टीरियल सस्पेंशन के 100 माइक्रोलीटर को क्रमिक रूप से पतला करें। और व्यक्तिगत आगर प्लेटों पर प्रत्येक कमजोर पड़ने के 20 माइक्रोलीटर प्लेट।
३७ डिग्री सेल्सियस पर एक रात इनक्यूबेशन के बाद, पिछले दिन से जीवाणु एकाग्रता की गणना करने के लिए सकल परीक्षा द्वारा कॉलोनी बनाने इकाइयों की संख्या गिनती । प्राप्तकर्ता जानवरों के उत्तेजनीय त्वचा घायल होने के लिए, माउस के पीछे दो इंच के खंड द्वारा शेविंग करने से पहले पैर की अंगुली चुटकी के लिए प्रतिक्रिया की कमी की पुष्टि करें। किसी भी आवारा बाल को हटाने के लिए धीरे-धीरे पोंछें।
और उजागर त्वचा को कीटाणुरहित करें, अनुक्रमिक 10% पोविडोन आयोडीन, और 70% इथेनॉल भिगोए हुए धुंध अनुप्रयोगों के साथ। सर्पिल पैटर्न में, सर्जिकल क्षेत्र के केंद्र से जावक चल रहा है। त्वचा को लगभग एक मिनट तक सूखने की अनुमति देने के बाद, तैयार सर्जिकल क्षेत्र के केंद्र में एक बाँझ छह मिलीमीटर पंच बायोप्सी को मजबूती से दबाएं।
त्वचा पर एक गोलाकार रूपरेखा बनाने के लिए पंच बायोप्सी को ट्विस्ट करें, जो त्वचा के ऊतकों के माध्यम से पूरी तरह से कटौती करता है, और रूपरेखा का कम से कम एक खंड। अंतर्निहित प्रावरणी या ऊतक में कटौती न करने का ख्याल रखना। फिर पंच बायोप्सी द्वारा अंकित परिपत्र पैटर्न के बाद, एपिडर्मिस और डर्मिस के माध्यम से काटने के लिए बाँझ कैंची, और संदंश का उपयोग करें।
स्टैफ ऑरियस टीका के लिए, तैयार बायोल्यूमिनेसेंट बैक्टीरियल इनोकुलेंट के 50 माइक्रोलीटर के साथ 28 गेज इंसुलिन सिरिंज भरें। और घायल जानवर के डर्मिस को साइड में खींचने के लिए एक उंगली का उपयोग करें। सिरिंज को ऊतक के लगभग समानांतर धारण करें, धीरे-धीरे सिरिंज को ऊतक में डालें जब तक प्रतिरोध में अचानक कमी महसूस न हो जाए।
प्रावरणी के भेदी का संकेत। घाव के केंद्र में रखी सुई के साथ, धीरे-धीरे अयोकुलेंट की पूरी मात्रा वितरित करें। पुष्टि करें कि अयोकुलेंट घाव के केंद्र में एक बुलबुला बनाता है, जिसमें न्यूनतम रिसाव या फैलाव होता है।
और जानवर से धीरे-धीरे सिरिंज निकाल दें। फिर पूरी वसूली तक गर्मी और निगरानी के साथ यह पिंजरे के लिए जानवर वापस । घायल और संक्रमण के बाद, और प्रयोग के दौरान दैनिक, एनेस्थेटाइज्ड माउस को बायोल्यूमिनेसेंट और फ्लोरेसेंस इमेजर में रखें, घाव के साथ जितना संभव हो उतना सपाट।
इमेजर सॉफ्टवेयर में, इमेजिंग मोड के रूप में ल्यूमिनेसेंस और फोटोग्राफ का चयन करें। एक्सपोजर समय छोटे बिनिंग पर एक मिनट के लिए पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए, चिकनाई के लिए एफ/स्टॉप 1, तस्वीर के लिए एफ/स्टॉप 8, और उत्सर्जन फिल्टर के लिए खुला । फिर छवि रिकॉर्ड करने के लिए अधिग्रहण पर क्लिक करें।
वीवो फ्लोरेसेंस इमेजिंग में, इमेजिंग मोड के रूप में फ्लोरेसेंस और फोटोग्राफ का चयन करें। एक्सपोजर समय छोटे बिनिंग में एक सेकंड के लिए पूर्व निर्धारित किया जाना चाहिए, एफ/फ्लोरेसेंस के लिए 1 बंद करो, एफ/तस्वीर के लिए 8 बंद करो, और उत्तेजन और उत्सर्जन 30 नैनोमीटर से अधिक ४६५ की तरंग दैर्ध्य, और ५२० से अधिक 20 नैनोमीटर, एक उच्च दीपक तीव्रता के साथ, क्रमशः । फिर छवि रिकॉर्ड करने के लिए अधिग्रहण पर क्लिक करें।
छवियों के दोनों सेट प्राप्त करने के बाद, पूर्ण वसूली तक निगरानी के साथ, जानवर को पिंजरे में वापस करें। छवि विश्लेषण के लिए, एक उपयुक्त छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर प्रोग्राम में निर्धारित करने के लिए छवि खोलें, और आसपास की त्वचा सहित पूरे घाव क्षेत्र पर ब्याज के डिफ़ॉल्ट परिपत्र क्षेत्र रखें। ब्याज के उपाय क्षेत्र पर क्लिक करें, और घाव के लिए मतलब प्रवाह के लिए मूल्यों को रिकॉर्ड, प्रत्येक संकेत के मतलब प्रवाह की अनुमति के लिए समय बनाम साजिश रची जा सकता है ।
घाव भरने को मापने के लिए, घाव के किनारे पर ब्याज के एक परिपत्र क्षेत्र को फिट करें, और बेसलाइन बनाम समय से आंशिक परिवर्तन की साजिश रचने की अनुमति देने के लिए सेंटीमीटर चुकता में घाव के क्षेत्र को मापें। इस प्रतिनिधि प्रयोग में, सशर्त ईजीएफपी अभिव्यक्ति मायलॉयड विभेदन प्राथमिक प्रतिक्रिया 88, या MyD88 नॉकआउट चूहों ने स्टैफ ऑरियस टीका के लिए अधिक संवेदनशीलता का प्रदर्शन किया, जितना गैर सशर्त ईजीएफपी ने जानवरों को व्यक्त किया था। संक्रमण के पहले आठ दिनों के दौरान 80% घातकता के साथ।
चूहों के दोनों उपभेदों ने संक्रमण के तुरंत बाद अपने शरीर के वजन का लगभग 5% खो दिया। हालांकि, चूहों को व्यक्त करने वाले सशर्त ईजीएफपी ने दो दिन तक अपने मूल वजन को बरामद किया । जबकि MyD88 चूहों नहीं था।
स्टैफ ऑरियस संक्रमण की उपस्थिति में घाव बंद करना दोनों उपभेदों के बीच अलग नहीं था। हालांकि, बाँझ घायल MyD88 नॉकआउट चूहों, घाव भरने में एक महत्वपूर्ण दोष था, सशर्त EGFP जानवरों को व्यक्त करने की तुलना में । पूरे पशु इमेजिंग एक उच्च जीवाणु बोझ से पता चला, के रूप में MyD88 नॉकआउट जानवरों के घावों में एक वृद्धि हुई बायोल्यूमिनेसेंट संकेत का सबूत है, सशर्त EGFP व्यक्त जानवरों की तुलना में ।
MyD88 नॉकआउट जानवरों के असंक्रमित घावों के लिए प्रारंभिक न्यूट्रोफिल तस्करी में ४०% की कमी भी सशर्त ईजीएफपी व्यक्त करने वाले जानवरों की तुलना में देखी गई । जब 1 x 10 स्टैफ ऑरियस की 7 वीं कॉलोनी बनाने इकाइयों को घायल होने के तुरंत बाद पेश किया गया था, तो जानवरों को व्यक्त करने वाले सशर्त ईजीएफपी की तुलना में नॉकआउट जानवरों में न्यूट्रोफिल तस्करी काफी क्षीण हो गई थी। बैक्टीरिया को वितरित करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सिरिंज में कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं, और सुई का स्थान घाव के केंद्र में सही ढंग से तैनात है।
घाव से ब्याज और जीवाणु प्रसार के प्रोटीन की अभिव्यक्ति को मापने के लिए अंत बिंदु पर पशु ऊतकों को काटा जा सकता है। स्टैफ ऑरियस मनुष्यों के लिए संक्रामक है। जैसे, बैक्टीरिया को संभालते समय व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहना जाना चाहिए, और रोगजनक युक्त सिरिंज को संभालते समय सावधानी बरती जानी चाहिए।
इस तकनीक ने स्टैफ ऑरियस संक्रमणों के लिए जैविक उपचारों के उपयोग का पता लगाने में मदद की है जो संक्रमण के खिलाफ मेजबान जन्मजात प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया को बढ़ाते हैं।
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