Immunology and Infection
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
En musmodell att bedöma medfödda immunsvaret mot Staphylococcus aureus -infektion
Chapters
Summary February 28th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Ett tillvägagångssätt beskrivs för realtid detektering av medfödda immunsvaret mot kutan såra och Staphylococcus aureus infektion av möss. Genom att jämföra LysM-andra möss (som äger fluorescerande neutrofiler) med en LysM-andra korsavlade nedsatt immunförsvar mus stam, vi i förväg vår förståelse av infektion och utveckling av metoder för att bekämpa infektion.
Transcript
Tekniker som övervakar bakteriebördan och en neutrofil svarar samtidigt kan ge insikt i mekanismerna i Staph aureus persistens och effekten av behandlingsstrategier. Den största fördelen med denna teknik är att flera parametrar kan mätas longitudinellt i en levande värd under hela varaktigheten av infektion. Det är viktigt att visa var man ska placera såret på en mus dorsum, hur man punktskatt huden, och hur man kan vaccinera såret med Staph aureus.
Börja med att tina bioluminescens Staph aureus stam av intresse från negativa 80 grader Celsius lagring på is. Innan strimmor kulturen på en 5%bovint blod agar tallrik. För en övernattning inkubation vid 37 grader Celsius.
Nästa morgon, överföra tre till fyra enskilda kolonier från Staph aureus plattan i tryptisk sojabuljong, eller TSB. Kompletteras med 10 mikrogram per milliliter kloramfenikol för en över natten skakning inkubation vid 37 grader Celsius. Nästa morgon späd 120 mikroliter odlingsprov i sex milliliter TSB.
Med 10 mikrogram per milliliter kloramfenikol, för en två timmars inkubation vid 37 grader Celsius, och 200 rotationer per minut. När den optiska densiteten vid 600 nanometer når 0,5, överför tre milliliter bakteriell suspension till 10 milliliter iskall DPBS. Efter noggrant dekantering supernatanten, tillsätt ytterligare kyld DPBS till pelleten, och vortexa de åter upphängda bakterierna noggrant.
Efter en andra centrifugering, åter upphäva bakteriepelleten i 1,5 milliliter PBS på is. För att verifiera bakteriekoncentrationen späds 100 mikroliter av bakterieupphängningen med en faktor på 1 x 10 till 4:e, och 1 x 10 till 5:e, i färsk PBS. Och platta 20 mikroliter av varje utspädning på enskilda agarplattor.
Efter en inkubation över natten vid 37 grader Celsius, räkna antalet kolonibildande enheter efter bruttoundersökning för att beräkna bakteriekoncentrationen från föregående dag. För excisional hud sårring av de mottagande djuren, bekräfta en brist på svar på tå nypa, innan rakning en en två tum avsnitt på baksidan av musen. Torka försiktigt för att ta bort eventuella herrelösa hårstrån.
Och desinficera den exponerade huden, med sekventiell 10%povidone jod, och 70%etanol indränkt gasbinda applikationer. Flytta utåt från centrum av operationsområdet, i ett spiralmönster. Efter att huden har torkat i ungefär en minut, tryck fast en steril sex millimeter punch biopsi i mitten av det förberedda kirurgiska området.
Vrid punch biopsi för att skapa en cirkulär kontur på huden, som helt skär genom huden vävnad, och minst en del av konturen. Var noga med att inte skära i den underliggande fascia eller vävnad. Använd sedan steril sax, och tärningar, för att skära genom epidermis och dermis, efter det cirkulära mönstret präglat av punch biopsi.
För Staph aureus inokulering, fyll en 28 gauge insulinspruta med 50 mikroliter av den beredda bioluminescerande bakteriell inokulat. Och använd ett finger för att dra dermis av det sårade djuret åt sidan. Håll sprutan nästan parallellt med vävnaden, sätt långsamt in sprutan i vävnaden tills en plötslig minskning av motståndet känns.
Indikerar piercing av fascian. Med nålen placerad i mitten av såret, långsamt leverera hela volymen av inokulanten. Bekräfta att inokulat bildar en bubbla i mitten av såret, med minimal läckage eller spridning.
Och ta bort sprutan långsamt från djuret. Sedan tillbaka djuret till det är bur med värme och övervakning tills full återhämtning. Efter sår och infektion, och dagligen under experimentet, placera den sövda musen i en bioluminescerande och florescence imager, med såret så platt som möjligt.
I bildprogrammet väljer lumininde och fotograferar som bildhanteringslägena. Exponeringstiden ska vara förinställd till en minut vid liten binning, F/Stop 1 för luminescens, F/Stop 8 för fotografi, och öppen för utsläppsfiltret. Klicka sedan på förvärva, för att spela in bilden.
För in vivo fluorescensavbildning väljer du fluorescens, och fotografera, som avbildningslägena. Exponeringstiden bör förinställas till en sekund vid små binning, F/Stop 1 för fluorescens, F/Stop 8 för fotografi, och Excitation and Emission våglängder på 465 över 30 nanometer, och 520 över 20 nanometer, med en hög lyktintensitet, respektive. Klicka sedan på förvärva för att spela in bilden.
Efter att ha fått båda uppsättningarna av bilder, returnera djuret till det är bur, med övervakning, tills full återhämtning. För bildanalys, öppna bilden som ska kvantifieras, i en lämplig bildanalys program, och placera standard cirkulär region av intresse över hela sårområdet inklusive den omgivande huden. Klicka på måttregion av intresse, och registrera värdena för medelvärdet för såret, för att tillåta medelvärdet för varje signal som ska ritas kontra tid.
För att mäta sårläkningen, passa en cirkulär region av intresse över sårkanten, och mäta området av såret i centimeter i kvadrat, för att möjliggöra plottning av den fraktionella förändringen från baslinjen kontra tiden. I detta representativa experiment, villkorlig EGFP uttryck myeloisk differentiering primära svar 88, Eller MyD88 knockout möss, visat en större mottaglighet för Staph aureus inokulering, än gjorde icke villkorliga EGFP uttrycker djur. Med en 80% lethality observerats under de första åtta dagarna av infektion.
Båda stammarna av möss förlorade cirka 5%av sina kroppsvikter omedelbart efter infektion. Men den villkorliga EGFP uttrycker möss återhämtade sina ursprungliga vikter av dag två. Medan MyD88 möss inte.
Sår stängning i närvaro av Staph aureus infektion var inte olika mellan de två stammarna. Emellertid, sterilt sårade MyD88 knockout möss, hade en betydande defekt i sårläkning, jämfört med villkorliga EGFP uttrycka djur. Hela djur imaging visade en högre bakteriell börda, vilket framgår av en ökad bioluminescerande signal i såren av MyD88 knockout djur, jämfört med villkorliga EGFP uttrycka djur.
En 40%minskning av inledande neutrofil handel med icke-infekterade sår av MyD88 knockout djur, observerades också jämfört med villkorliga EGFP uttrycka djur. När 1 x 10 till den 7: e kolonin bildar enheter av Staph aureus infördes omedelbart efter sår, neutrofil handel var betydligt försvagad i knockout djur jämfört med villkorliga EGFP uttrycka djur. Innan du doserar bakterierna, se till att det inte finns några luftbubblor i sprutan, och att nålens placering är korrekt placerad i mitten av såret.
Djurvävnader kan skördas vid slutpunkten för att mäta uttryck av proteiner av intresse och bakteriespridning från såret. Staph aureus är smittsamt för människor. Som sådan, personlig skyddsutrustning bör bäras när du hanterar bakterierna, och försiktighet bör iakttas, när du hanterar en spruta som innehåller patogenen.
Denna teknik har hjälpt utforska användningen av biologiska behandlingar för Staph aureus infektioner som förbättrar värdar medfödda immunsvar mot infektion.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
