A Real-Time potens analyse for chimeric antigen reseptor T celler målretting solid og hematologiske kreftceller

xCELLigence sanntidscelleanalyse gjør det mulig å kvantitativt overvåke drapet på kreftceller ved immunceller under etikettfrie forhold og i løpet av flere dager. Dette systemet gir et komplett tidsforløp av målkreftcelledrap slik at samtidig screening av et stort antall konstruksjoner, effektorcelletyper eller kombinasjonsbehandlinger ved lav effektor til målforhold. Begynn med å så 1,5 ganger 10 til de syv HEK293FT-cellene i DMEM kulturmedium i en 150 milliliter cellekulturrett for en overnattingsinkubasjon ved 37 grader Celsius og 5% karbondioksid med fuktighet.

Neste morgen, bland 2,5 milliliter transfection fortynningsløsning supplert med fem mikrogram lentiviral vektor plasmid DNA og 22,5 mikrogram lentiviral emballasje blanding med 82,5 mikroliter transfection reagens i 2,5 milliliter transfection fortynning løsning. Etter en 15 minutters inkubasjon ved romtemperatur, overfør reaksjonsfallet klokt inn i parabolen til HEK293FT-celler og returner cellene til inkubatoren for en andre overnattingsinkubasjon. Neste morgen, erstatte supernatant med 19 milliliter av frisk DMEM kultur medium og returnere cellene til inkubatoren over natten.

Samle supernatanten i et enkelt 50 milliliter konisk rør for fire grader Celsius lagring for de neste to dagene før sedimentering av lentivirus ved sentrifugering på den andre morgenen for å fjerne celler eller rusk fra løsningen. Overfør alt unntatt omtrent en milliliter av lentiviruset som inneholder supernatant til et ultraklart sentrifugerør for ultracentrifugation. Etter ultracentrifugation, forsiktig aspirere gjenværende virus som inneholder supernatant, forsiktig legge til 100 mikroliter dmem til pellet, og plassere røret på is i 15 minutter.

På slutten av inkubasjonen, bland oppløsningen forsiktig og aliquot lentivirusløsningen i forhåndskjølte sterile rør for lagring ved minus 80 grader Celsius. Deretter bestemmer titer av lentivirus ved kvantitativ RT-PCR i henhold til produsentens instruksjoner. For CAR-T cellegenerering og utvidelse, aktiver en til to ganger 10 til de seks perifere blod mononukleære cellene i en milliliter CAR-T cellemedium med like mange CD3 / CD28 belagte mikroperler i en brønn av en 24-brønns plate i cellekulturinkubatoren i 24 timer.

Følgende to morgener, bland en mikroliter av transduksjon enhancer middel med cellene etterfulgt av tillegg av lentivirus ved et mangfold av infeksjon på fem til en. Overvåk T-celleveksten hver to til tre dager og legg til nytt CAR-T-cellemedium etter behov for å opprettholde cellene ved en til to ganger 10 til de seks cellene per milliliter konsentrasjon. For å oppdage T-celle CAR uttrykk ved flyt cytometri, overføre tre ganger 10 til den femte CAR og ikke-transdusert T-celler i individuelle 1,5 milliliter mikrocentrifuge rør.

Samle cellene ved sentrifugering og gjenbruk pellets i 200 mikroliter FACS buffer supplert med 1% menneskelig serum. Del hver celleprøve i 100 mikroliter aliquots i individuelle fem milliliter polystyren FACS rør på is. Etter fem minutter, legg til en mikroliter av biotinylert FAB2 fragmenter av geit anti-mus FAB2 til ett rør av hver celletype og to mikroliter av PE-merket anti-tag antistoff til det andre røret av hver celletype med grundig blanding.

Etter 30 minutter på is, vask cellene med tre milliliter frisk FACS buffer og etter sentrifuging dekantere supernatantene. Resuspend pellets i de gjenværende supernatant og legge til to mikroliter av APC anti-CD3 og to mikroliter på 7-AAD til hvert rør. Tilsett en mikroliter pe-merket Streptavidin med kort blanding til røret farget med anti-FAB2 antistoff og inkuber alle rørene på is i 30 minutter.

På slutten av inkubasjonen analyserer du cellene ved flytcytometri i henhold til standardprotokoller som gating T-cellene ved fremoversprytning versus sidespry og CD3 versus 7-AAD-uttrykk. For en cytolysestyrkeanalyse i sanntid, legg til 50 til 100 mikroliter av målcellekulturmedium til hver brønn av en e-plate og mål bakgrunnsimpedansen i et celleanalysatorinstrument. Oppdag målkreftcellene fra kulturplaten ved hjelp av trypsin.

Vask cellene i 15 milliliter friskt kulturmedium og sentrifuge. Resuspend kreftcellepellet i fem milliliter friskt medium for telling og justere celletettheten til riktig målcellekonsentrasjon. Legg cellene til riktig antall brønner og la e-platen stå i 30 minutter ved romtemperatur slik at cellene kan bosette seg jevnt på bunnen av brønnene.

På slutten av likevektsperioden plasserer du platen i sanntidscelleanalysatoren og starter måling av impedansen automatisk hvert 15. Vedheft og spredning av målcellene kan spores i sanntid. Neste morgen fortynner du effektorEN CAR og kontrollerer T-cellene til riktig konsentrasjon i individuelle rør og fjerner 50 til 100 mikroliter fra hver brønn av e-platen slik at det endelige volumet i hver brønn er 100 mikroliter.

Deretter frø effektoren og kontrollere T-celler i de aktuelle brønnene på riktig effektor til målforhold i 100 mikroliter av middels per brønn. Deretter likevekt e-platen i 30 minutter ved romtemperatur før du returnerer platen til celleanalysatorsystemet. For å måle effekten av T-cellen mediert drap på målkreftcellene, overvåke CAR-T mediert drap i 96 timer.

Omtrent 50% av CAR-T-cellene farget positivt for anti-enkeltkjede variabel fragment antistoff som indikerer uttrykket av CAR i ca 50% av T-cellene. I dette representative eksperimentet ble det brukt en effekt på 10 til én effektor til målforhold for alle gruppene. Raji celler bare og CD22-CAR T celle behandlet Raji celler viste betydelig drap i forhold til kontroll T celle bare og Mock CAR-T cellegrupper.

I dette eksperimentet var bare CD47-CAR-T-cellene effektive for å drepe kreftcellene i bukspyttkjertelen. Videre var impedanssignalet fra CD47-CAR-T-cellene alene bare litt over celleindekssignalet målt i de middels alene brønnene som indikerer at impedanssignalet som følge av suspensjonsceller som CAR-T-celler er minimale og ikke bidrar til det generelle impedanssignalet når CAR-T-celler legges til målkreftcellene. Spesielt ble GITR-co-stimulerende domenet observert å være mer effektivt for å forbedre CAR-T-celledrap mot epitelvekstfaktorreseptorpositive målceller sammenlignet med originale CAR-konstruksjoner uten GITR-domenet.

Mediet fra e-platebrønner kan samles inn for å analysere cytokinprofilen på tidspunkter enten under eller etter analysen i henhold til eksperimentets behov. Samlet sett har xCELLigence forbedret effektiviteten ved å evaluere styrken til ulike immunterapier som spenner fra tospesifikke T-celleak engagerer og onkolytiske virus til immunkontrollpunkthemmere i kombinasjonsbehandlinger.