用于表征复杂天然有机质混合物的单通量互补高分辨率分析技术

全球范围内，湿地估计含有529 Pg的碳（C），主要以有机碳的形式埋藏于泥炭沉积物中¹目前，这类泥炭地作为净碳汇，每年封存29 Tg C^-1 仅在北美地区¹然而，环境扰动（如排水、火灾、干旱和温度升高）会通过加速有机质分解，导致碳损失增加，从而抵消这一碳汇效应。 通过 温室气体（二氧化碳 [CO₂] 和甲烷 [CH₄]) 的生成^1,2气候变化可能导致碳流失，如果温度升高或气候变干会促进微生物对碳的分解速率。或者，温度升高和大气CO₂浓度增加可能通过增强植物生长而增加碳输入，从而部分抵消碳分解的增加。₂ 浓度可能促进初级生产，从而固定更多的CO₂ 为有机碳（OC）。该有机碳被分解为CO的程度和速率如何₂ 和 CH₄ 取决于电子供体底物、电子受体的可利用性以及介导转化过程的微生物之间的复杂相互作用。在许多情况下，这些机制尚未被充分表征，因此它们对环境扰动的响应尚不明确，气候变化对泥炭地生态系统碳平衡的最终影响仍不清楚。

天然有机质（NOM）结构复杂，使得历史上即使要鉴定其混合物中存在的有机化合物也极为困难。近年来的技术进步显著提升了我们对这些化合物的表征能力，其中许多化合物传统上被视为难降解的腐殖酸或富里酸类物质，且在一定程度上至今仍被如此归类。^3,4,5我们现在了解到，这些化合物中的许多实际上可被微生物利用，如果提供了合适的末端电子受体（TEA），就可能被分解。^6,7计算化合物中碳的名义氧化态（NOSC）可为预测其分解潜力及所需终端电子受体（TEA）的能量产率提供量化指标。然而，该计算需要对有机质进行分子水平的表征。⁷NOSC 由分子式计算得出 通过 以下方程⁷：NOSC = − ((−z + 4(#C) + (#H) − 3(#N) − 2(#O) + 5(#P) − 2(#S)) / (#C)) + 4，其中 z 为净电荷。NOSC 与热力学驱动力相关⁸，其中NOSC较高的化合物更容易降解，而NOSC较低的化合物则需要能量更高的TEA才能被还原。NOSC低于−2的化合物需要高能量产出的TEA（如O₂）才能发生还原反应。₂，硝酸盐或Mn^IV，且无法被常见的低能量产出的电子受体（如Fe）降解^III 或硫酸盐⁷。在湿地常见的积水缺氧环境中，这一点尤为重要₂ 以及其他高能量产出的终端电子受体较为稀缺⁹ 因此，在这些条件下，较低NOSC化合物的降解在热力学上受到限制。环境扰动可通过影响O的水文变化，进而影响生态系统的热力学状态₂ （能量最高的电子受体）、由初级生产所提供的有机底物和电子受体的变化，以及在较小程度上受温度的影响。湿地系统中温度效应的一个重要实例体现在同型产乙酸作用（homoacetogenesis）所发生的权衡关系中即，一氧化碳产生乙酸₂ 和 H₂）和利用氢的产甲烷作用（即, CH₄ CO 的生成₂ 和 H₂）。在较低温度下，同型乙酸生成似乎略占优势，而较高温度则有利于CH₄ 生产¹⁰。这种温度效应可能对生态系统对气候变化的响应具有重要意义，因为CH₄ 是一种比CO更强的温室气体₂¹¹ 从而增加CH的生成₄ 以一氧化碳为代价₂ 在较高温度下可能会加剧气候变暖的正反馈效应。

泥炭地通过微生物对天然有机质的呼吸作用，产生具有全球重要意义的 CO₂ 和 CH₄⁶。有机碳底物的氧化态碳数（NOSC）决定了所产生的 CO₂ 与 CH₄ 的相对比例，这一参数至关重要，因为 CH₄ 的辐射强迫效应高于 CO₂¹¹，同时建模研究也已将该比例确定为估算泥炭地碳通量的关键参数¹²。在不存在除 CO₂ 以外的终端电子受体的情况下，通过电子平衡可以证明：NOSC > 0 的有机碳底物将产生 CO₂:CH₄ > 1 的比例；NOSC = 0 的有机碳产生等摩尔的 CO₂ 和 CH₄；而 NOSC < 1 的有机碳则产生 CO₂:CH₄ < 1 的比例¹³。自然生态系统中有机碳（OC）的分解由微生物介导，因此即使特定化合物的降解在热力学上是可行的，其反应速率仍受微生物酶活性的动力学限制，并且在缺氧条件下还受到热力学驱动力（即，NOSC）的制约⁷。迄今为止，全面表征有机质仍具挑战性，因为其中所含化合物的多样性需要多种互补的技术手段进行分析。近期的技术进展已弥补了这一空白；通过一系列分析技术，我们能够对广泛的有机化合物进行分子水平的表征，某些情况下还可实现定量分析，涵盖从葡萄糖等小分子初级代谢物到分子量达 800 Da 的多杂环化合物。过去，此类大而复杂的分子通常仅被笼统归类为“类木质素”或“类单宁”，并假定其难以降解。然而，分子水平的表征使得即使对这些大分子复杂化合物也能计算其 NOSC 值。这些 NOSC 值与热力学驱动力呈线性相关，从而可用于评估可供分解利用的有机质质量，结果表明在许多情况下，即使在湿地普遍存在的缺氧条件下，这些复杂分子实际上仍可能被微生物降解。

由于引入 O₂ 可使几乎所有自然观测到的 NOSC 值的有机物发生分解，因此本文重点关注湿地（i.e.，O₂ 受限）系统中有机物和微生物蛋白质组学的变化，这些变化可能是驱动此类系统的主要因素。然而，我们讨论的所有技术均可应用于来自任何生态系统的有机物。通常，基于光学和荧光分析的综合测量方法已被用于评估有机物质量^3,14。然而，使用此类综合测量方法时，大量分子被归入腐殖质或富里酸等泛称类别中，导致精细结构信息丢失。这些类别的定义尚不明确，实际上可能因研究而异，从而导致无法进行比较。此外，综合测量无法提供计算系统热力学所必需的分子层面细节，因此在真正评估有机物质量方面存在局限¹⁵。

傅里叶变换离子回旋共振质谱法（FTICR-MS）、核磁共振（NMR）波谱法、气相色谱-质谱联用（GC-MS）和液相色谱-质谱联用（LC-MS）等单独技术确实能够提供此类分子水平的详细信息。尽管这些技术各自存在一定的局限性，但它们也具备独特的优势，可通过整合方法加以利用，以获得从严格的热力学意义上量化有机质质量所需的精细分子信息。GC-MS 有助于鉴定可能对 CO 具有直接作用的关键小分子代谢物₂ 和 CH₄ 生产（例如,葡萄糖，乙酸盐 等等。）；然而，气相色谱-质谱联用技术（GC-MS）需依赖标准品进行验证，因此仅限于数据库中已知化合物的鉴定，无法识别新化合物。此外，GC-MS是一种半定性技术，只能推断相对浓度的变化，无法提供计算吉布斯自由能等所需的绝对浓度信息。最后，GC-MS在分析前需对分子进行衍生化处理，这限制了其对分子量小于约400 Da的化合物的分辨能力，且在干燥步骤中易导致挥发性醇类损失。

一维（1D） ¹液态核磁共振（1H NMR）可对小分子代谢物（包括初级小分子代谢物及挥发性物质，如乙醇、乙酸、丙酮、甲酸、丙酮酸、琥珀酸、短链脂肪酸，以及在基于质谱的方法中通常缺失或受损的一系列碳水化合物）进行高度定量的表征，其浓度数据在热力学参数计算中尤为有用。然而，与气相色谱-质谱联用（GC-MS）类似，复杂混合物的一维核磁共振（1D NMR）需依赖数据库进行标准化，因此单独使用时难以便捷地鉴定在复杂且动态变化的自然生态系统中可能大量存在的新型化合物。此外，核磁共振的灵敏度低于基于质谱的技术，因此只有使用配备氦冷却低温探头的核磁共振系统，才能实现浓度高于1 µM的定量代谢物分析。值得注意的是，部分核磁共振低温探头具有耐盐性，在使用较小直径（< 3 mm 外径样品管¹⁶然而，核磁共振（NMR）的另一个复杂因素是存在大量顺磁性金属和矿物质（例如,Fe 和 Mn 含量高于 1 - 3 wt%)，这在高地土壤中可能含量较高，会导致光谱特征变宽，从而增加核磁共振（NMR）谱图解析的难度。采用固相萃取（SPE）可通过减少矿物盐含量并提高谱图质量，有助于基于NMR和质谱（MS）的代谢组学方法的解析。

直接进样FTICR-MS是一种高度敏感的技术，能够从单个样品中检测出数以万计的代谢物，但无法捕获乙酸、丙酮酸和琥珀酸等关键的小分子代谢物，且在检测糖类及其他碳水化合物方面素来具有挑战性¹⁷，也无法提供定量信息。然而，与其他技术不同，傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）在鉴定新型化合物并确定其分子式方面表现卓越，因此能够识别出最多数量的化合物，提供的分子信息也超过其他所述任何技术。这一点具有重要意义，因为FTICR-MS（及其他技术）所提供的分子信息可用于计算NOSC，而NOSC与决定某些化学反应发生可能性的热力学驱动力相关。⁸ 及其在特定条件下的速率⁷此外，将傅里叶变换离子回旋共振质谱（FTICR-MS）与分离技术（如液相色谱联用串联质谱）相结合，可获得定量的结构信息，从而弥补该技术的部分局限性。液相色谱-质谱（LC-MS）适用于鉴定其他方法难以表征的类脂化合物及其他代谢物。将液相色谱-傅里叶变换离子回旋共振质谱（LC-FTICR-MS）或液相色谱-质谱（LC-MS）与组分收集器联用，收集特定未知目标组分，并通过二维（2D）液态核磁共振（NMR）进行结构解析，是鉴定和定量未知化合物的理想策略。^18,19然而，这一步骤非常耗时，仅在需要时才使用。单独来看，每种技术仅能提供有机质的不同侧面信息，而通过整合这些技术，我们能够获得比单独使用任一技术更全面的理解。

尽管热力学因素决定了系统中可能发生转化的最终限制条件，但有机质的分解过程是由微生物介导的，其酶活性控制着反应速率。因此，要充分理解有机质分解的调控机制以及最终的温室气体（CO₂₂ 和 CH₄湿地中温室气体的产生需要采用整合组学方法来表征微生物酶活性以及代谢物。本文介绍了一种利用单一样品进行综合分析的方法，通过连续提取策略实现完全配对的分析结果。该方法在代谢物、蛋白质和脂质提取（MPLex）方案的基础上进行了拓展，将蛋白质组学与气相色谱-质谱（GC-MS）和液相色谱-质谱（LC-MS）相结合。²⁰ 通过整合定量代谢物信息来鉴定小分子代谢物、蛋白质和脂质 通过 核磁共振与较大次级代谢产物的鉴定 通过 FTICR-MS。与MPLex略有不同，本方案首先进行水相提取，随后使用极性依次降低的溶剂进行连续提取。所有提取步骤均在同一份样品上进行，这在样品体积有限或难以获取时可节约样本量，并减少因非均质样品基质中分装 aliquots 差异所引入的实验误差。例如,土壤和泥炭）或储存条件与时间的差异。

最后，通过将有机质分析与微生物群落的蛋白质组学分析相结合，我们可以构建描述有机质分解途径及其转化过程的代谢网络。这使我们能够检验关于系统扰动将如何影响最终CO₂排放的具体假设。₂ 和 CH₄ 通过改变可利用的有机底物、电子受体以及介导反应的微生物群落来调控产物生成 通过 酶催化剂的活性。

该方法的总体目标是提供一种高通量的实验流程，能够从单一样本中同时分析代谢物、脂质和微生物蛋白，从而生成完全配对的数据集，用于构建代谢网络，并有效控制分析误差。