Medicine
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प्राथमिक संस्कृतिक माउस में ऑक्सीजन की खपत दर का विश्लेषण एक Extracellular फ्लक्स विश्लेषक का उपयोग कर नवजात Cardiomyocytes
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Summary February 13th, 2019
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इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य कैसे विभिंन कारकों दिल में ऑक्सीजन की खपत को बदल सकते है की जांच करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में माउस नवजात cardiomyocytes का उपयोग करने के लिए वर्णन है ।
Transcript
यह प्रोटोकॉल हमें उच्च द्वि-बीबीटी को अलग और संस्कृति करने की अनुमति देता है, जिसे केवल माउस कार्डियोमायोसाइट्स के लिए जाना जाता है। माइटोकॉन्ड्रियल फ़ंक्शन का मूल्यांकन करने के लिए, कार्डियोमायोसाइट्स की ऑक्सीजन खपत दर का विश्लेषण वास्तविक सिल्वर फ्लक्स एनालाइजर द्वारा किया जा सकता है। इस तकनीक के फायदों में से एक यह है कि कार्डियोमायोसाइट्स की ऑक्सीजन खपत को 96-अच्छी प्रारूप में उनके अनुयायी राज्य में आसानी से मापा जा सकता है, जो बड़ी संख्या में प्रतिकृति के साथ कई स्थितियों के परीक्षण को सक्षम बनाता है।
यह पोत कार्डियोलॉजी के अनुसंधान क्षेत्र में महत्वपूर्ण अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। ऑक्सीजन की खपत के अलावा, हम अन्य मेटाबोलिक मापदंडों जैसे ग्रेग्रिस और पेरासिड एपोक्सिडेशन का भी अध्ययन कर सकते हैं। कार्डियोमायोसाइट्स की उच्च परिवर्तनशीलता प्राप्त करना इस प्रयोग के लिए महत्वपूर्ण है।
इसके लिए दिलों के कुशल पाचन की जरूरत होती है। चूंकि नवजात कार्डियोमायोसाइट्स बहुत नाजुक होते हैं, इसलिए कार्डियोमायोसाइट्स की कोमल हैंडलिंग भी महत्वपूर्ण है। सेल कल्चर हुड में, 5 मिलीलीटर एचबीबीएस 6-वेल सेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में और इसे बर्फ पर रखें।
इसके अलावा, 10 सेमी सेल कल्चर डिश के लिए एचबीएसएस के एलिकोट 10 मिलीलीटर, फिर, 50 मिलीलीटर बाँझ शंकु नली में 20 मिलीलीटर ट्राइप्सिन प्रीफिजेशन समाधान तैयार करें। बर्फ पर सभी समाधान रखें। इसके बाद, दिल निकालें और इसे तुरंत बाँझ सेल संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें जिसमें एचबीएस शामिल है।
किसी भी अवशिष्ट फेफड़ों के ऊतकों और बड़े जहाजों को हटा दें। कोमल आंदोलन का उपयोग कर एचबीबीएस में दिल धोएं। इसके बाद, ठीक कैंची के साथ दिल को 8 टुकड़ों में काट लें और दिल के ऊतकों को एचबीबीएस के साथ 6-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट के एक कुएं में संदंश के साथ स्थानांतरित करें।
एक मोरिया चम्मच का उपयोग करके, एचबीबीएस से भरी 6-अच्छी प्लेट में इसे अच्छी तरह से अच्छी तरह से स्थानांतरित करके दिल के ऊतकों को धोएं। फिर दिल के ऊतकों को एक शंकु नली में स्थानांतरित करें जिसमें 20 मिलीलीटर ट्राइप्सिन होता है और कोमल आंदोलन के साथ 4 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करता है। इस प्रक्रिया में, 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में कोलेजनेस पाचन समाधान को पूर्व से आगे करें।
दिल के ऊतकों और पूर्व अपच समाधान युक्त शंकु नली को 4 डिग्री सेल्सियस से सेल कल्चर हुड में स्थानांतरित करें। दिल के ऊतकों को ट्यूब के नीचे सिंक करने दें और 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके प्रीफिच्येशन समाधान को हटा दें। इसके बाद, ट्यूब में एचबीएसएस के 10 मिलीलीटर जोड़ें।
10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके ट्राइप्सिन को धोने के लिए एचबीबीएस 2 से 3 बार के साथ दिल के ऊतकों को फिर से खर्च करें। एचबीएसएस को एस्पिरेट करें और हृदय ऊतक के साथ ट्यूब में प्रीवार्म्ड कोलेजनस पाचन समाधान के 10 मिलीलीटर जोड़ें। पहले पाचन के लिए, बिना किसी आंदोलन के 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में दिल के ऊतकों के साथ ट्यूब को इनक्यूबेट करें।
इसके बाद, ट्यूब को सेल कल्चर हुड में स्थानांतरित करें। 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके इसे धीरे-धीरे 10 बार रीसस्ट करके ऊतक को ट्रिट करें। इससे दिल तितर-बितर हो जाएगा और कोशिकाओं को हृदय के ऊतकों से छोड़ा जा सकेगा।
अपाच्य ऊतक सिंक होने दें। कार्डियोमायोसाइट्स में समृद्ध पचा समाधान को एक नई शंकु नली में स्थानांतरित करें और कोलेजनेस पाचन को रोकने के लिए तुरंत समान मात्रा में सेल संस्कृति माध्यम जोड़ें। फिर शेष अपाच्य हृदय ऊतक युक्त ट्यूब में 10 मिलीलीटर कोलेजनस पाचन समाधान जोड़ें।
दूसरे पाचन के लिए, 10 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पानी स्नान में दिल के ऊतकों के साथ ट्यूब को इनक्यूबेट करें। पहले पाचन की प्रक्रियाओं को दोहराएं और कोलेजनेस पाचन को रोकने से पहले कार्डियोमायोसाइट्स में समृद्ध पचाने वाले समाधान को एक नई शंकु नली में स्थानांतरित करें। इसके बाद, एक बाँझ 50 मिलीलीटर शंकु नली में एक बाँझ सेल छलनी रखें।
सेल कल्चर मीडियम के 2 से 3 मिलीलीटर के साथ सेल छन्नी को प्री-वेट करें और सेल छन्नी के जरिए कोशिकाओं को पास करें। इसके बाद सेल कल्चर मीडियम के साथ सेल छन्नी को खंगाल डाला। फिर, 180 बार गुरुत्वाकर्षण पर 5 मिनट के लिए कार्डियोमायोसाइट्स युक्त शंकु नली को अपकेंद्रित्र करें।
5 मिनट के बाद, सुपरनेट को एस्पिरेट करें और सेल कल्चर मीडियम के 10 मिलीलीटर में सेल पेलेट को फिर से खर्च करें। कोशिकाओं को 10 सेमी सेल कल्चर डिश पर प्लेट करें और उन्हें एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। इसके बाद धीरे-धीरे थाली को उत्तेजित करें।
गैर-अनुयायी कोशिकाओं को धोएं और 10 मिलीलीटर सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके डिश पर सेल कल्चर माध्यम को बार-बार पाइपिंग करके कोशिकाओं को फिर से खर्च करें। फिर, गैर-अनुयायी कोशिकाओं को एक नए 10 सेमी सेल संस्कृति पकवान में स्थानांतरित करें और उन्हें एक घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। एक घंटे के बाद, धीरे से थाली उत्तेजित और गैर अनुयायी कोशिकाओं को धोने ।
कार्डियोमायोसाइट्स को एक नई 50 मिलीलीटर शंकु नली में स्थानांतरित करें। इसके बाद, 96-अच्छी तरह से सेल कल्चर प्लेट के प्रत्येक कुएं में कोटिंग समाधान के 50 माइक्रोलीटर को अलीकोट करके 96-अच्छी संस्कृति प्लेट तैयार करें। यदि बुलबुले मौजूद हैं, तो उन्हें 20 माइक्रोलीटर पिपेट का उपयोग करके हटा दें।
मैट्रिक्स कोटिंग के सूखने की अनुमति देने के लिए कम से कम एक घंटे के लिए प्लेट को 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट करें। फिर, हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके कोशिकाओं की गणना करें। अतिरिक्त सेलुलर मैट्रिक्स में कोशिकाओं प्लेट 10 से ३०००० कोशिकाओं के बीच एक घनत्व पर ९६-अच्छी तरह से सेल संस्कृति प्लेट लेपित प्रति अच्छी तरह से ।
और कोशिकाओं को इनक्यूबेटर में रखें। ऑक्सीजन की खपत परख को फिर से तैयार करने के लिए, कम से कम 3 घंटे के लिए एक प्रवाह विश्लेषक सेंसर कारतूस हाइड्रेट, उपयोगिता प्लेट के प्रत्येक कुएं में कैलिब्रेंट समाधान के 200 माइक्रोलीटर जोड़ें। सेंसर कारतूस को यूटिलिटी प्लेट पर वापस रखें और कम से कम 3 घंटे के लिए CO2 या O2 पूरकता के बिना 37 डिग्री सेल्सियस में इनक्यूबेट करें।
परख से एक घंटे पहले, धीरे-धीरे कोशिका संस्कृति माध्यम को हटा दें और कोशिकाओं को प्रीवार्मेड माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट माध्यम के 200 माइक्रोलीटर से दो बार धोएं। दूसरे वॉश के बाद प्रीवार्मेड माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट मीडियम के 175 माइक्रोलीटर डालें। फिर कार्बन डाइऑक्साइड या ऑक्सीजन पूरकता के बिना 37 डिग्री सेल्सियस पर कोशिकाओं को संस्कृति।
माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट मीडियम में प्रत्येक टेस्ट कंपाउंड्स में से 3एमएल तैयार करें। एक मल्टी-चैनल पिपेट का उपयोग करके सेंसर कारतूस के इंजेक्टर बंदरगाहों में प्रत्येक यौगिक के 25 माइक्रोलीटर लोड करें। कोशिकाओं की स्थिति और किसी भी पूर्वउपचार अधिकतम बहाली को प्रभावित कर सकते हैं जो अनकूपल एफसीसीपी के इंजेक्शन द्वारा प्राप्त किया जाता है।
अनकूपलर के प्रति सेल संवेदनशीलता भी बदल सकती है, इसलिए, प्रत्येक विशेष उपचार के लिए एफसीसीपी की कामकाजी एकाग्रता को अनुकूलित करना महत्वपूर्ण है। इसके बाद, अतिरिक्त सेलुलर प्रवाह परख प्रोटोकॉल स्थापित करें और कार्यक्रम शुरू करें। सबसे पहले, अंशांकन के लिए सेंसर कार्तिरिज को मशीन में डालें।
एक बार अंशांकन कदम किया जाता है परख प्लेट के लिए अंशांकन की जगह । यदि वांछित है, परख के बाद, ध्यान से एक बहु चैनल पिपेट का उपयोग कर सभी परख माध्यम त्यागें । और प्रोटीन परख का उपयोग करके भविष्य की कोशिका सामान्यीकरण के लिए सेल कल्चर मिरकॉलेट को नकारात्मक 20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
वर्णित प्रोटोकॉल का उपयोग करके, दिल दिन से अलग थे 0 नवजात पिल्ले और कार्डियोमायोसाइट्स 96-अच्छी प्लेटों में 10, 20 या 30 हजार कोशिकाओं प्रति अच्छी तरह से के घनत्व में वरीयता प्राप्त थे। रातोंरात संस्कृति के बाद, कार्डियोमायोसाइट्स को लेपित प्लास्टिक की सतह से अच्छी तरह से जुड़ा हुआ पाया गया और बहुत कम असंबद्ध कोशिकाएं थीं। इस बिंदु पर, अनायास अनुबंध कार्डियोमायोसाइट्स आसानी से दिखाई दे रहे थे।
कोशिकाओं के फैलने के साथ ही सीडिंग के एक दिन बाद एक दिन संगम दिखाया गया। कार्डियोमायोसाइट्स को एक कार्डियोमायोसाइट विशिष्ट मार्कर सारकोमरिक अल्फा ऐक्टिनिन के खिलाफ एंटीबॉडी के साथ इम्यूनो दाग दिया गया था। जैसा कि यहां दिखाया गया है, अधिकांश कोशिकाओं ने कार्डियोमायोसाइट अलगाव की उच्च शुद्धता का संकेत देते हुए अल्फा ऐक्टिनिन के सकारात्मक धुंधला दिखाया।
यहां एक ठेठ माइटोकॉन्ड्रियल स्ट्रेस टेस्ट की एक योजना दिखाई गई है । माइटोकॉन्ड्रियल तनाव परीक्षण ऑक्सीजन खपत दर के बेस लाइन माप के साथ शुरू होता है, इसके बाद ओलिगो मायोसिन का इंजेक्शन होता है जो ATPA को रोकता है। फिर, अधिकतम ऑक्सीजन खपत दर को मापने के लिए अनकपलिंग एजेंट एफसीसीपी को इंजेक्ट किया गया ।
अंत में, दो इलेक्ट्रॉन परिवहन परिसर अवरोधकों के इंजेक्शन के साथ, माइटोकॉन्ड्रियल श्वसन पूरी तरह से बंद हो जाता है और ओसीआर अपने निम्नतम स्तर तक कम हो जाता है। लगातार और प्रजनन योग्य परिणाम प्राप्त करना। उच्च जीवित रहना प्राप्त करना महत्वपूर्ण है।
इसलिए, नवजात शिशुओं का उपयोग करना महत्वपूर्ण है और कार्डियोमायोसाइट्स में दिल के ऊतकों को धीरे से संभाला जाता है। नए या मौजूदा आनुवंशिक रूप से हेरफेर माउस लाइनों का उपयोग करके, इस विधि को आसानी से डेटा में अनुवाद किया जा सकता है जो दिल में बायोएरेटिक विनियमन के लिए नए तंत्र को समझने का कारण बन सकता है। माइटोकॉन्ड्रियल दिल समारोह में महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं।
हम इस विधि से उम्मीद करते हैं कि ऑक्सीकरण चयापचय को विनियमित करने वाले उपन्यास नियामकों और रास्तों की पहचान करने और दिल की विफलता के इलाज के लिए नए चिकित्सीय लक्ष्य खोजने में मदद मिलेगी।
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