Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Real-time opvolgen van de DNA Strand Exchange reactie gemedieerd door Rad51
Chapters
Summary February 13th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Fluorescentie resonantie energie overdracht gebaseerde real-time opvolgen systemen van DNA strand uitwisseling reactie gemedieerd door Rad51 werden ontwikkeld. Met behulp van de protocollen die hier gepresenteerd, zijn wij kundig voor speurder van de vorming van reactie tussenproducten en hun omzetting in producten, terwijl ook het analyseren van de enzymatische kinetiek van de reactie.
Transcript
Deze methode kan helpen bij het ontcijferen van de stappen in DNA-streng uitwisseling en onthult de molecuul rollen van verschillende eiwitten die betrokken zijn bij combinatie tijdens reparatie. Met deze techniek kunnen we dna-strenguitwisseling in real time monitoren zonder verstoring van de reactie en de operatiekamer gebruiken om de kinetiek van elke reactiestap te bepalen. Met enkele kleine aanpassingen kan deze techniek worden toegepast om de activiteiten van gezuiverde recombinatie-eiwitten afkomstig van andere soorten, zoals zoogdieren en planten, te bestuderen.
Het aantonen van de procedure zal Kentaro Ito zijn, een Post Doc uit mijn laboratorium. Om te beginnen bereidt u de reactiebuffer A volgens het tekstprotocol voor. Voeg vervolgens 36-nanomole 16FA-oligonucleotide toe aan de buffer voor de DNA-koppelingstest.
Incubeer het mengsel op 37 graden Celsius gedurende vijf minuten. Voeg RAD-51 eiwit met een uiteindelijke concentratie van 1,5 micro moedervlekken aan het mengsel en uitbroed het op 37 graden celsius gedurende vijf minuten. Voeg SWI5-SFR1 eiwit met een uiteindelijke concentratie van 0,15 micro moedervlekken aan het mengsel, en uitbroed het op 37 graden Celsius voor een extra vijf minuten.
Breng 1,5 milliliter van het mengsel in een 1,0 bij 1,0 cm kwarts cuvette met een magnetische roerder. Steek de cuvette in een spectrofluorometer en ga verder met het aanpassen van de temperatuurregelaar en de magnetische roerder. Nota van de verandering in fam fluorescentie emissie op 525 nanometer bij excitatie op 493 nanometer met een seconde intervallen gedurende 100 seconden.
Tot slot, met een spuit, injecteren ROX gelabeld dubbelstrenged DNA bij een uiteindelijke concentratie van 36 nano mollen in de cuvette. Noteert de verandering in fluorescentie emissie met een seconde intervallen gedurende 30 minuten. Om de fluorescentiespectra tussen de substraten en de eindproducten te vergelijken, voegt u elke cuvette met de 16 FA-oligonucleotiden met of zonder RAD-51 gedurende vijf minuten in een spectrofluorometer en incubbate bij 37 graden Celsius.
Vervolgens registreert u de FAM-fluorescentie-emissie op 500 tot 600 nanometer bij excitatie op 493 nanometer. Om het effect van RAD-51 op de fluorescentiespectra te testen, voegt u RAD-51 toe bij een uiteindelijke concentratie van 1,5 micromol. En het mengsel vijf minuten lang uitbroeden bij 37 graden Celsius.
Tot slot, record de fluorescentie spectra van 500 tot 600 nanometer bij excitatie op 493 nanometer. De maximale FRET-efficiëntie wordt verkregen door de maximale vermindering van de fluorescentieintensiteit te meten wanneer alle enkelstrengs DNA-substraat in de koppelingstest wordt omgezet in dubbelstrengs DNA. Of door de maximale toename van de intensiteit te meten wanneer alle dubbelstrengs DNA-substraat in de verplaatsingstest wordt omgezet in enkelstrengs DNA.
In beide tests had de toevoeging van RAD-51-eiwit geen invloed op de fluorescentie-emissie van FAM, of de blusefficiëntie ervan door rotsen. De gevolgen van de spontane reacties tussen substraatA's en het verdere fotobleken zijn klein. Zoals blijkt uit de verwaarloosbare veranderingen in de emissie van FAM zonder RAD-51, vergeleken met de aanzienlijke veranderingen die met RAD-51 worden gezien.
Het toevoegen van het SWI5-SFR1 complex stimuleert sterk de koppelingsactiviteit van RAD-51. De koppelingsreactie wordt gesimuleerd met behulp van een driestappenmodel, bestaande uit de vorming van de eerste drie-strengen tussenliggende, overgang in de tweede tussenliggende, en het vrijgeven van de single-stranded DNA en de vorming van de hetero duplex. Een vergelijking van het driestappenmodel met een model in twee stappen geeft aan dat het driestappenmodel beter geschikt is voor het simuleren van DNA-koppeling, zonder of met het SWI5-SFR1-complex.
De berekende evenwichtsconstante van elke reactiestap, met of zonder SWI5-SFR1, toont aan dat het SWI5-SFR1 complex de vorming van de eerste drie-strengentussengang niet stimuleert, maar sterk de overgang tussen de twee drie-strengentussenproducten en het vrijkomen van SS DNA stimuleert. Het is van essentieel belang na te gaan of elke partij gezuiverd eiwit vrij is van nuclease en helicasebesmetting.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
