Biochemistry
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Påvisning av protein ubiquitination nettsteder av peptid berikelse og masse spektrometri
Chapters
Summary March 23rd, 2020
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi presenterer en metode for rensing, deteksjon og identifisering av diGly peptider som stammer fra ubiquitinerte proteiner fra komplekse biologiske prøver. Den presenterte metoden er reproduserbar, robust og overgår publiserte metoder med hensyn til dybdenivået i ubiquitinome-analysen.
Transcript
Den post translasjonelle modifikasjonen av proteiner av det lille proteinet ubiquitin er involvert i mange hendelser i cellen. Denne studien presenterer et originalt tillegg til verktøykassen for proteinubiquitination analyse. Vi bruker berikelsesteknikker og massespektrometri for å avdekke det dype ubiquitinome.
Vi har gjort flere forbedringer i analysen av diGly peptider som stammer fra ubiquitinated proteiner. Disse inkluderer rå peptid fraksjonering før berikelse, og anvendelsen av mer avanserte peptid fragmentering innstillinger i Orbitrap. Til sammen resulterer dette i en større dekning av ubiquitinome.
Flere aspekter av protokollen er vanskelig å beskrive med ord. Visualisering av noen av de viktigste trinnene er avgjørende for å kunne gjenta disse analysene av ulike operatorer i et annet laboratorium. Prosedyren vil bli demonstrert av Karel Bezstarosti, som er senior tekniker i laboratoriet mitt.
Begynn med å forberede kultiverte celler eller mus hjernevev for eksperimentet. Hvis du arbeider med celler, lyse cellen pellet fra en 150 centimeter kvadrert kulturplate i to milliliter iskald, 50 millimolar Tris HCL med 0,5% natrium deoxycholate. Kok lysatet ved 95 grader Celsius i fem minutter.
Deretter sonikere det ved fire grader Celsius i 10 minutter. Hvis du bruker in vivo mus hjernevev, lyse det i en iskald buffer som inneholder 100 millimolar Tris HCL, 12 millimolar natrium deoxycholate og 12 millimolar natrium N-lauroylsarcosinate. Sonicate lysate i 10 minutter ved fire grader Celsius.
Kok det deretter i fem minutter ved 95 grader Celsius. Deretter kvanter den totale proteinmengden ved hjelp av et kalorimetrisk absorbans BCA proteinanalysesett, som bør være minst flere milligram for vellykket diGly peptidimmunoprecipitation. For SILAC-eksperimenter blander du de lette og tunge merkede proteinene i et ett til ett forhold basert på den totale proteinmengden.
Reduser alle proteiner med fem millimolar DTT i 30 minutter ved 50 grader Celsius. Og deretter alkylate dem med 10 millimolar iodoacetamid i 15 minutter i mørket. Utfør deretter proteinfordøyelsen med Lys-C i fire timer.
Og trypsin fordøyelsen over natten på 30 grader Celsius, eller ved romtemperatur. På neste dag, dele prøven i to to milliliter Eppendorf rør og legge TFA til fordøyd prøven til en endelig konsentrasjon på 0,5%Sentrifuge den på 10,000 ganger G i 10 minutter for å utløse og fjerne alt vaskemiddel. Samle peptidet som inneholder supernatant for påfølgende fraksjonering.
Bruk høy pH omvendt fase C18 kromatografi for å fraksjonere tryptiske peptider. Forbered en tom seks milliliter kolonnepatron fylt med 0,5 gram stasjonært fasemateriale for ca 10 milligram proteinfordøye. Legg peptidene på den tilberedte kolonnen og vask den med ca. 10 volumer på 0,1%TFA, etterfulgt av 10 mengder vann.
Elute peptidene i tre fraksjoner ved hjelp av 10 kolonnevolumer på henholdsvis 10 millimolar ammoniumformat med henholdsvis syv, 13,5 og 50 %acetonitril. Deretter litholyse alle fraksjoner. En batch av ubiquitin rester motiv antistoffer konjugert til protein En agarose perle slurry er delt inn i seks like fraksjoner.
Oppløs de tre peptidfraksjonene i henhold til manuskriptets retninger og spinn ned ruskene. Tilsett supernatantene til de tre brøkene til perleslurken mens du holder de tre andre brøkene på is. Og inkuber dem i to timer ved fire grader Celsius på en rotatorenhet.
Deretter spinner du ned perlene. Overfør det overnaturlige til en frisk batch av perler. Og gjenta inkubasjonen med de resterende tre perleslamkefraksjonene.
Oppbevar supernativa for påfølgende global proteomanalyse. Og overfør perlene til 200 mikroliter pipettespisser utstyrt med en GFF filterplugg. Sett spissene i 1,5 milliliter rør utstyrt med en sentrifuge tips adapter og vaske perlene tre ganger med 200 mikroliter iskald IAP buffer, etterfulgt av tre vasker med iskaldt renset vann.
Spinn ned kolonnene på 200 ganger G i to minutter mellom vaskene, og pass på at du ikke lar kolonnen kjøre tørr. Etter den siste vasken, elute peptidene med to sykluser ved 50 mikroliter på 0,15% TFA. Desalt peptidene med en C18-trinnsspiss og tørk dem med vakuumsentrigering.
Utfør LC-MS/MS-eksperimenter på et sensitivt massespektrometer skrevet til et nanostrøms LC-system. Kolonnen er satt opp i henhold til manuskriptretninger og holdt på 50 grader Celsius. Bruk massespektrometeret i dataavhengig anskaffelsesmodus.
Samle MS1 massespektra ved høy oppløsning med en automatisert forsterkning kontrollert målinnstilling på 4E5 og en maksimal injeksjonstid på 50 millisekunder. Utfør massespektrometrianalysen i mest intens første modus, ved hjelp av topphastighetsmetoden med en total syklustid på tre sekunder. Utfør deretter en ny runde med DDA MS-analyse i minst intens første modus, noe som sikrer optimal påvisning av lave overflodspeptider.
Filtrer forløperionene i henhold til deres ladetilstander og monoisotopisk toppoppdrag. Og utelukke tidligere forhørte forløpere dynamisk i 60 sekunder. Isoler peptidforløpere med et quadrupole massefilter satt til en bredde på 1,6 Thomson.
Deretter samle MS2 spektra i ion fellen på en automatisert gevinst kontroll av 7E3 med en maksimal injeksjonstid på 50 millisekunder og HCD kollisjon energi på 30% Analyser massespektrometri råfiler ved hjelp av en passende søkemotor, for eksempel fritt tilgjengelig MaxQuant programvarepakke basert på Andromeda søkemotor. Åpne MaxQuant, og velg de riktige rådatafilene. Angi antall prosessorer og klikk på kategorien Gruppespesifikke parametere.
Velg fordøyelse, og tillate tre tapte cleavages. Velg deretter endringer og legg diGly til de variable endringene. Velg kategorien globale parametere, og legg til riktig proteinsekvensdatabase.
La de andre innstillingene være som standard, og trykk start for å utføre databasesøket. For kvantitativ analyse av SILAC eksperimentfiler, angi mangfoldet til to, og velg de tunge aminosyreetikettene. Når søket er ferdig, importerer du tekstfilene til Perseus.
Denne protokollen ble brukt til å identifisere ubiquitination steder i proteiner fra kultiverte celler og in vivo materiale ved å oppdage diGly peptider med nanoflow LC-MS / MS. Flere forbedringer ble gjort i den eksisterende protokollen som resulterte i høyere antall oppdagede diGly peptider. En råoljefraksjon i tre fraksjoner ble utført før immunforebutning.
En av brøkene inneholder ubiquitins egen K48 modifisert tryptisk diGly peptid, som er preget av en bred topp i LC kromatogram. Videre ble peptidfragmenteringsregimet justert for å kombinere LC-MS-løpene med de høyeste første og laveste første fragmenteringsregimene i dataanalyseprosedyren, som produserte mer enn 4000 ekstra unike diGly peptider. Mer enn 23, 000 diGly peptider kan rutinemessig identifiseres fra en enkelt prøve av HeLa celler behandlet med en proteasom hemmer.
Av alle diGly peptider identifisert over tre biologiske replikere skjermer, mer enn 9,000 var til stede i alle tre, mens mer enn 17,000 var til stede i minst to av tre repliker. Antall peptid identifikasjoner er svært betinget av mengden av inndatamateriale. Et omtrentlig antall identifiserte diGly peptider kan forventes avhengig av startmaterialet, men disse tallene er bare estimater og vil også avhenge av hvilken type massespektrometer som brukes.
Når du utfører denne protokollen, tidligere erfaring med massespektrometri basert proteomics metoder og håndtering og analysere minutt prøvebeløp ville sikkert være en fordel. MaxQuant-programvaren kan erstattes av en annen databasesøkealgoritme. Også en annen type massespektrometer kan brukes.
Resultatene i form av peptid identifikasjoner kan litt variere, men dette er typisk for noen massespektrometri basert proteomics analyse. Ubiquitin er viktig i utviklingen av mediert proteinforringelse, men spiller også en rolle i mange andre prosesser i cellen. Dypere kunnskap om ubiquitin som en post translasjonell modifikasjon er avgjørende for å bedre forstå sin funksjon.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
