自达尔文以来 物种起源¹，科学家通过洞穴生物获得了关于性状如何在特定环境和生态压力下发生进化性改变的深刻见解²墨西哥 tetra， A. mexicanus，包括分布在墨西哥各地及美国南部德克萨斯州河流中的有眼祖先型“表层”种群，以及至少29个地理上相互隔离的衍生洞穴形态种群，后者栖息于阿布拉山脉及墨西哥东北部其他地区³已鉴定出多种与洞穴相关的性状 A. mexicanus包括耗氧量改变、脱色、眼睛退化以及摄食和觅食行为的改变⁴^,⁵^,⁶^,⁷^,⁸^,⁹. A. mexicanus 由于具有明确的进化历史、对生态环境的详细表征以及独立进化的洞穴种群，该模型为研究趋同进化机制提供了一个强有力的体系¹⁰^,¹¹许多在洞穴鱼中存在的洞穴衍生性状，包括眼睛退化、睡眠减少、摄食增加、群游行为丧失、攻击性降低以及应激反应减弱，已通过独立起源多次演化形成，且不同洞穴种群间常利用不同的遗传通路实现这些性状的演化。⁸^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵这一重复演化是其重要特征 A. mexicanus 系统，并有助于深入理解更普遍的问题，即如何通过扰动遗传系统以产生相似的表型。

尽管遗传技术在多种鱼类物种（包括 A. mexicanus），斑马鱼领域的最新进展为鱼类遗传技术的开发奠定了基础¹⁶,¹⁷,¹⁸,¹⁹^,²⁰. 斑马鱼中广泛使用多种工具来操控基因表达，这些操作流程早已实现标准化。例如，在单细胞阶段注射吗啉代寡核苷酸（MOs）可选择性阻断RNA并抑制翻译，从而在发育的短暂时间窗口内实现基因功能的敲低²¹^,²²此外，基因编辑技术（如成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白9（Cas9）和转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN））能够通过基因组中的重组实现特定的缺失，或在某些情况下实现插入。¹⁹^,²⁰^,²³^,²⁴转基因技术用于以细胞类型特异性的方式操控基因的稳定表达或功能。 Tol2 系统通过共注射转座酶mRNA与转座子载体，可高效用于转基因动物的制备 Tol2 含有转基因的DNA质粒²⁵^,²⁶。该 Tol2 系统利用了 Tol2 转座酶用于青鳉以产生转基因构建体的稳定生殖系插入。生成 Tol2 转基因技术涉及共注射一种质粒，该质粒包含两侧带有侧翼序列的外源基因 Tol2 整合位点和 mRNA Tol2 转座酶¹⁷该系统已被用于在斑马鱼中产生一系列转基因品系，近年来其应用已扩展到其他新兴的模式生物系统，包括慈鲷、鳉鱼、刺鱼，以及最近的墨西哥洞穴鱼。²⁷^,²⁸,²⁹,³⁰.

尽管洞穴鱼是阐明性状进化机制的一个引人入胜的生物系统，但其作为进化模型的全部潜力尚未得到充分开发。部分原因在于难以直接操控其遗传和细胞功能³¹。虽然已通过数量性状位点（QTL）研究鉴定出调控复杂性状的候选基因，但这些候选基因的验证仍存在困难³²,³³^,³⁴。近年来，已采用吗啉代寡核苷酸进行瞬时敲低、利用CRISPR和TALEN系统进行基因编辑，以及通过Tol2介导的转基因技术，来研究多种性状背后的遗传基础³⁵,³⁶,³⁷,³⁸。这些技术的实施与标准化将有助于深入探究生物性状的分子与神经机制，包括基因功能的操控、特定细胞群体的标记以及功能性报告基因的表达。尽管这些遗传工具在新兴模式系统中已成功用于操控基因或细胞功能，但在A. mexicanus中仍缺乏详细的实验方案。

A. mexicanus 为研究生物在环境变化下的进化机制提供了重要见解，并为鉴定调控多种性状的新基因创造了机会。多种因素表明，A. mexicanus 是一个极为适用的模型，可用于应用目前在成熟遗传模型中已建立的基因组工具，这些优势包括易于在实验室中饲养、产卵量大、胚胎透明、基因组已测序以及具备明确的行为学检测方法³⁹。本文描述了在A. mexicanus 的表型鱼和洞穴鱼种群中使用吗啉环寡核苷酸（morpholinos）、转基因技术和基因编辑技术的方法。这些工具在A. mexicanus 中的广泛应用，将有助于从机制层面深入探究洞穴鱼与表型鱼在发育、生理和行为差异背后的分子过程。

洞穴动物为研究多种形态学、发育学和行为学特征提供了极具吸引力的研究体系。然而，建立这一模式系统的一个限制因素是缺乏能够操控基因功能的遗传学工具。本文中，我们展示了三种不同的方法，用于在墨西哥洞穴鱼（Astyanax mexicanus）中操控基因功能。

这些工具将有助于研究表层鱼与洞穴鱼之间自然变异的基因基础，以及这些基因如何与表型相关联。我实验室中一位出色的博士后 Bethany Stahl 将演示该实验步骤。在开始操作前，先用温热的、溶解于养鱼系统水中的 3% 琼脂糖填充一个 100 毫升的培养皿，然后以 45 度角小心地将一枚卵注射模具插入琼脂糖中，在缓慢下压模具时需避免在模具下方困住空气。

当琼脂糖凝固后，小心移除模具，然后将培养板在4°C下保存，最长可保存一周。随后，根据制造商的说明，使用电极拉针仪从硼硅酸盐玻璃毛细管中拉制针头。在注射当天，用玻璃移液器将单细胞卵转移到注射板中，每行放置30至40枚卵，最多填充注射板的五行。

用少量鱼系统水保持卵的湿润。将吗啉代（Morpholino）在冰上解冻，并配制注射液，使每枚卵注射400皮克吗啉代，可使用长型Microloader移液器吸头，或在末端加入2至4微升的溶液。当所有针头装载完毕后，用镊子剪去注射针尖端多余的长度，并将第一根针安装到连接皮升微量注射器的显微操作仪上。

然后，将注射皿置于解剖显微镜下，使用显微操作仪用注射针刺入每个卵细胞，并将一纳升的吗啉代寡核苷酸注射液直接注入卵黄中。对于CRISPR注射，将25皮克的向导RNA与300皮克的CRISPR相关蛋白9信使RNA混合，将所得RNA溶液两纳升注入每个胚胎，操作如所示。对于Tol2转座酶及两侧带有Tol2序列的质粒注射，将每微升25纳克的Tol2信使RNA与每微升25纳克的Tol2质粒构建体及酚红溶于无RNase的水中。

然后，按照刚刚演示的方法，向每个胚胎注射一纳升溶液。在注射后第四天筛选注射了吗啉环寡核苷酸（Morpholino）的动物时，根据目标基因的不同，可在体视显微镜下观察鱼胚幼虫的表型，或进行录像以分析其行为。若需筛选CRISPR插入缺失突变（indels），则将注射了CRISPR的胚胎转移至PCR管中，并按照标准的聚合酶链式反应（PCR）DNA提取流程提取DNA，用于后续PCR分析。

为评估诱变效果，取5 µL PCR产物在3%琼脂糖凝胶中以70伏电压电泳运行3小时。野生型未诱变DNA将呈现清晰条带，而突变DNA则呈现弥散条带。与注射随机序列Morpholino的表型鱼相比，注射对照Morpholino的墨西哥洞穴鱼（Cave A mexicanus）在24小时内表现出显著增强的运动活性及减少的睡眠时间。

与对照组注射的表层鱼相比，注射促食欲素（hypocretin orexin）Morpholino 对表层鱼的睡眠影响甚微。相反，通过注射

墨西哥洞穴鱼基因功能的操作