ダーウィンの種の起源¹、以来科学者は洞窟生物²のおかげで、定義された環境および生態学的な圧力への応答では、形質が進化の過程で形づけられるに深い洞察力を得ています。メキシコのテトラ、 A. メキシコメキシコと南テキサス中の河川に生息する目の祖先 '表面' 集団シエラ・デル・アブラに生息する派生洞窟モーフの少なくとも 29 の地理的に隔離された集団の構成と北東メキシコ³の他の領域。A. メキシコ、変更された酸素消費量、色素脱失、目の損失餌と採餌行動⁴^,⁵^,⁶^{、変更などで識別された洞窟関連形質の数} ⁷^,⁸^,⁹。独立して明確に定義された進化の歴史、生態学的環境の詳細な評価との存在により収斂進化のメカニズムを調査するための強力なモデル進化洞窟A. メキシコプレゼント人口¹⁰^,¹¹。血脈、目の損失などがある、睡眠の損失、餌、スクーリングの損失の増加、侵略を減少とストレス反応を減少、独立した起源は、しばしば活用を通じて複数回を進化している洞窟の派生形質の多く様々な遺伝的経路間⁸^,¹²^,¹³^,¹⁴^,¹⁵の洞窟します。これには、 A. メキシコシステムの強力な側面は、どのように遺伝的システムのより一般的な質問への洞察力は似たような表現型を生成するため、提供して進化が繰り返されます。

ゼブラフィッシュにおける最近の進歩が魚の遺伝的技術開発の基礎を提供する遺伝子の機能解明のための遺伝子の技術のアプリケーションは、多くの魚種 ( A. メキシコを含む) に限定されている、しながら¹⁶、¹⁷、¹⁸、¹⁹^,²⁰。数多くのツールは遺伝子発現を操作するゼブラフィッシュで広く使用されて、これらの手順の実装を標準化されている長い間。たとえば、単細胞段階で morpholino oligos (MOs) の噴射は選択的に RNA をブロックし、開発²¹^,²²中簡単な時間窓の変換を防ぐことができます。さらに、遺伝子編集アプローチなど定期的にクラスター化された空間短い回文繰り返し (CRISPR) CRISPR 関連タンパク質 9 (Cas9) と転写活性化因子のようなエフェクターヌクレアーゼ (TALEN) に定義された削除の生成を可能にします。または、いくつかのケースでは、ゲノム¹⁹^,²⁰^,²³^,²⁴の再結合を挿入します。遺伝子は、細胞型固有の方法で安定した遺伝子発現または関数の操作に使用されます。メダカ Tol2システムを効果的に coinjecting トランスポサーゼによるトランスジェニック動物を生成する使用 transgene²⁵^,²⁶を含んでいるメダカ Tol2 DNA プラスミッドと mRNA。メダカ Tol2システムは、安定した生殖細胞系遺伝子組換え construct17 の挿入を生成するめだかのメダカ Tol2転移を利用しています。メダカ Tol2遺伝子組み換えを生成するには、メダカ Tol2転移¹⁷メダカ Tol2統合サイトと mRNA が並ぶ遺伝子を含むプラスミドを coinjecting が含まれます。ゼブラフィッシュにおけるトランスジェニックは行の配列を生成するこのシステムを使用されているし、その使用は最近追加する創発モデルシステム、シクリッド、メダカ、トゲウオなどに拡大し、もっと最近のメキシコ毒²⁷^、 ²⁸,²⁹,³⁰です。

血脈は形質の進化のメカニズム解明のための魅惑的な生物学的システムが、進化モデルとしてその完全な能力が完全に利用されてないです。これは部分的に遺伝子を操作することができないのためにされており、携帯機能直接³¹。複雑な形質を制御する候補遺伝子群は量的形質遺伝子座 (QTL) の研究を使用して識別されているが、これらの候補者の遺伝子の検証は困難な³²、³³^,³⁴。最近では、morpholinos、遺伝子 CRISPR と TALEN システムとメダカ Tol2の使用を使用して編集を使用して一時的なノックダウン-仲介された遺伝子の遺伝的基盤の特徴³⁵、³⁶、37^{の数を調査する使用されています。}、³⁸。定義された細胞集団の標識遺伝子機能の操作を含む、生物学的特性の分子・神経基盤の調査操作の実装とこれらの技術の標準化可能になると機能的な記者の式です。遺伝子や細胞の機能を操作するこれらの遺伝的ツールの実装を成功させる、創発モデルシステムで実証されているに対し、詳細なプロトコルはまだA. メキシコに欠けています。

A. メキシコ環境の変化への応答の進化のメカニズムに重要な洞察力を提供する、多様な特徴を制御する新規遺伝子群を特定する機会を提示します。A. メキシコ研究室、ひな大型の魚を簡単に維持する能力を含む、確立された遺伝的モデルで現在利用可能な確立されたゲノムツールの適用の非常に扱いやすいモデルである要因の数が提案します。透明性、配列されたゲノムと定義された行動アッセイ³⁹。ここでは、morpholinos、遺伝子導入、遺伝子編集a. メキシコの表面と洞窟の集団での使用のための方法論について述べる。血脈と表層魚群の発達、生理学、行動の違いの進化の基礎となる分子プロセスに制御機構解明のためA. メキシコでこれらのツールの広範なアプリケーションになります。

洞窟動物は、多様な形態、発達、行動特性を調査するための説得力のあるシステムを提供します。しかし、このモデルシステムを確立する際の制限要因の1つは、遺伝子機能を操作できる遺伝的ツールの欠如です。ここでは、メキシコの洞窟魚、アスティアナックス・メキシカンスの遺伝子機能を操作するための3つの異なるアプローチを示します。

これらのツールは、表面魚と洞窟魚の間の自然なバリエーションの根底にある遺伝子の調査と、それらが型素型とどのように関連しているかを調査することを可能にします。私の研究室の才能あるポスドクであるベサニー・スタールは、この手順をデモンストレーションします。手順を開始する前に、魚のシステムの水に溶解した暖かい3%アガロースで100ミリリットルのペトリ皿を充填し、慎重に45度の角度でアガロースに卵射出型を入れ、金型の下の空気をトラップしないようにアガロースにゆっくりと下げます。

アガロースが固まったら、慎重にカビを取り出し、最大1週間、摂氏4度でプレートを保管してください。その後、ボロケイ酸ガラスの毛細血管とメーカーのガイドラインに従って電極針の引き手から針を引っ張ります。注射日には、ガラスピペットを使用して単一細胞の卵を注入プレートに移し、1行あたり30〜40個の卵で最大5列の注入プレートを充填します。

少量の魚のシステム水で卵を水分補給してください。氷の上にモルフォリーノを解凍し、長いマイクロローダーピペットチップを使用するか、最後に2〜4マイクロリットルボーラスを追加することによって、卵あたり400ピコグラムのモルフォリノが注入されるように注入液を調製します。すべての針がロードされたら、鉗子を使用して注射針の先端から余分な長さをトリミングし、最初の針をピコリットルマイクロインジェクターに接続されたマイクロマニピュレーターに取り付けます。

次に、注射皿を解剖顕微鏡の下に置き、マイクロマニピュレーターを使用して各卵を針で浸透させ、モルフォリーノ注射液のナノリットルを直接黄身に注入します。CRISPR注射の場合、25ピコグラムのガイドRNAとCRISPR関連タンパク質9メッセンジャーRNAの300ピコグラムを混合し、得られたRNA溶液の2ナノリットルを各胚に注入します。Tol2トランスポザーゼとTol2横ばいプラスミド注射の場合、Tol2メッセンジャーRNAのマイクロリットル当たり25ナノグラムを、RNaseフリーウォーターのトル2プラスミドコンストラクトのマイクロリットル当たり25ナノグラムとフェノールレッドを組み合わせます。

その後、ちょうど実証したように、各胚に1ナノリットルの溶液を注入します。モルフォリーノ注入動物を注射後4日でスクリーニングするには、目的の遺伝子に応じて、魚の幼虫をステレオ顕微鏡で可視化し、注射された動物の表現型を観察するか、またはビデオ記録

メキシコの血脈遺伝子機能の操作