מניפולציה של פונקציית ג'ין Cavefish מקסיקני

חיות מערות מספקות מערכת משכנעת לחקירת תכונות מורפולוגיות, התפתחותיות והתנהגותיות מגוונות. אבל אחד הגורמים המגבילים בהקמת מערכת מודל זו הוא מחסור בכלים גנטיים שיאפשרו לנו לתפעל את תפקוד הגנים. כאן אנו מדגימים שלוש גישות שונות כדי לתפעל את תפקוד הגנים דג המערה המקסיקני, Astyanax מקסיקניוס.

כלים אלה יאפשרו את חקירת הגנים שבבסיס הווריאציות הטבעיות בין דגי פני השטח לבין דגי המערה וכיצד הם מתייחסים לפנוטיפים. בת’אני סטול, פוסט-דוק מוכשר במעבדה שלי ידגים את ההליך הזה. לפני תחילת ההליך, למלא צלחת פטרי 100 מיליליטר עם חם 3% agarose מומס במים מערכת הדגים בזהירות למקם עובש הזרקת ביצה לתוך אגרוז בזווית של 45 מעלות, לפני לאט להוריד את התבנית לתוך התעוררות כדי למנוע לכידת אוויר מתחת לתבנית.

כאשר התעוררות התגבשה, להסיר בזהירות את התבנית ולאחר מכן לאחסן את הצלחת בארבע מעלות צלזיוס עד שבוע. לאחר מכן למשוך מחטים נימי זכוכית borosilicate ו מושך מחט אלקטרודה על פי הנחיות היצרן. ביום ההזרקה, השתמש פיפטה זכוכית להעביר ביצים תא יחיד לתוך צלחת ההזרקה, מילוי עד חמש שורות של צלחת ההזרקה עם 30 עד 40 ביצים לכל שורה.

שמור את הביצים hydrated עם כמות קטנה של מים מערכת דגים. להפשיר מורפולינו על קרח ולהכין את פתרון ההזרקה כך 400 picograms של מורפולינו מוזרק לכל ביצה באמצעות קצה פיפטה Microloader ארוך או הוספת בולוס שניים עד ארבעה מיקרוליטר עד הסוף. כאשר כל המחטים נטענו, השתמש בממטרים כדי לקצץ את האורך העודף מקצות מחט ההזרקה ולהרים את המחט הראשונה לתוך מיקרומניפולטור המחובר למיקרו-מינג’קטור פיקוליטר.

לאחר מכן, מניחים את צלחת ההזרקה תחת מיקרוסקופ ניתוח ולהשתמש micromanipulator לחדור כל ביצה עם המחט לפני הזרקת ננוליטר אחד של פתרון הזרקת מורפולינו ישירות לתוך החלמון. להזרקת CRISPR, יש לערבב 25 פיקוגרמות של RNA מנחה עם 300 פיקוגרמות של חלבון 9 שליח RNA הקשור ל-CRISPR ולהזריק שני ננוליטרים של תותר ה-RNA שנוצר לכל עובר כפי שהוכח. עבור טול2 טרנספוזאז ו Tol2 אגף הזרקת פלסמיד, לשלב 25 ננוגרם לכל microliter של RNA שליח Tol2 עם 25 ננוגרם לכל microliter של Tol2 מבנה פלסמיד ו פנול אדום במים נטולי RNase.

ואז להזריק ננוליטר אחד של פתרון לתוך כל עובר כפי שהוכח רק. כדי לסנן את בעלי החיים שהוזרקו למורפולינו בארבעה ימים לאחר הזרקתם, בהתאם לגן המעניין, דמיינו את זחלי הדגים תחת מיקרוסקופ סטריאו כדי לבחון את הפנוטיפ של בעלי החיים המוזרקים או את הקלטת הווידאו כדי למדוד התנהגות. כדי לסנן עבור אינדלי CRISPR, להעביר עוברים מוזרקים CRISPR לתוך צינורות PCR ולחלץ את ה-DNA על פי פרוטוקולי מיצוי DNA סטנדרטיים לתגובת שרשרת פולימראז או ניתוח PCR.

כדי להעריך עבור mutagenesis, להפעיל חמישה microliters של המוצר PCR על ג’ל 3%agarose ב 70 וולט במשך שלוש שעות. דנ”א פראי ולא מוטגני יגרום ללהקה מובחנת, בעוד שדנ”א מוטנטי יגרום לרצועה מרוחה. מערה מקסיקניוס מוזרק עם מורפולינו שליטה מציג באופן משמעותי יותר פעילות לוקומוטורית ושינה מופחתת על פני תקופה של 24 שעות, לעומת דגים פני השטח מוזרק עם מורפולינו מקושקשות.

הזרקת hypocretin orexin Morpholino יש השפעה מועטה על שינה בדגים פני השטח לעומת דגים מוזרק שליטה. לעומת זאת, היפוקרטין orexin נוקאאוט באמצעות הזרקת מורפולינו יש השפעה משמעותית על שינה בדגים שוכני מערה, מתן קשר ישיר בין ביטוי hypocretin orexin ואובדן שינה. מוטציה מתווכה CRPSR של הגן לבקנות OCA2 בדגים פני השטח תוצאות אנשים מסוימים homozygous עבור סוג הבר OCA2 אלל חיובי, והוא קשור מחסה פיגמנטציה, ואילו אנשים שיש להם שני עותקים של אלל OCA2 מוטציה CRISPR הם לבקן, מתן קשר ישיר בין הגן OCA2 מוטציה לבקנות בדגים מערה.

בחר חיובי של F0 עבור הטרנסג’נדר המשודר Tol2 כדי לחצות בחזרה לסוג הפראי כדי ליצור קווי F1 יציבים. זה מאפשר הדמיה סידן חי לחשיפת הבדלים בפעילות העצבית, תיווך שינויים התנהגותיים בסביבת המערה, הנחת היסודות לביטוי של מהומשים רבים נוספים כדי לאפיין ולתפעל תפקוד גנים במקסיקו. הדברים החשובים ביותר לזכור הם לטעון את הביצים בחוזקה על הצלחת, לקצץ את המחט כראוי, כדי לייעל את microinjection.

לאחר הפלה גנטית מוצלחת, אינטגרציה טרנסג’נדרית או עריכת גנים בתווך CRISPR, ניתן להשתמש בדגים אלה לניתוחים התפתחותיים, התנהגותיים ופעילות מוחית.