Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Манипуляции функции гена в мексиканской Cavefish
Chapters
Summary April 22nd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Мы описываем подходы для манипулирования генов в системе Эволюционная модель Астианакт гракл. Описываются три различных методов: Tol2-опосредованной трансгенез, целенаправленные манипуляции генома используя ТРИФОСФАТЫ/Cas9 и сногсшибательно выражения с использованием морфолиновая. Эти инструменты должны облегчить прямое расследование генов, лежащие в основе различия между формами поверхности и пещера жилище.
Transcript
Пещерные животные обеспечивают непреодолимую систему для исследования различных морфологических, развития и поведенческих признаков. Но одним из ограничивающих факторов в создании этой модельной системы является отсутствие генетических инструментов, которые позволили бы нам манипулировать функцией генов. Здесь мы демонстрируем три различных подхода к манипулированию функцией генов у мексиканской пещерной рыбы Astyanax mexicanus.
Эти инструменты позволят изузнать гены, лежащие в основе естественных вариаций между поверхностными рыбами и пещерными рыбами, и то, как они соотносятся с фенотипами. Бетани Шталь, талантливая постдок в моей лаборатории, продемонстрирует эту процедуру. Перед началом процедуры, заполнить 100 миллилитров Петри блюдо с теплой 3%agarose растворяется в воде рыбной системы и тщательно поместите форму инъекции яйца в агарозу под углом 45 градусов, прежде чем медленно опуская плесень в агарозу, чтобы избежать захвата воздуха под плесенью.
Когда агароза затвердеет, тщательно удалите форму, затем храните тарелку при четырех градусах по Цельсию в течение одной недели. Затем вытяните иглы из борозиликатных стеклянных капилляров и электрода иглы шкив в соответствии с руководящими принципами производителя. В день инъекции используйте стеклянную пипету для переноса одноклеточных яиц в инъекционной пластине, заполняя до пяти рядов инъекционной пластины 30-40 яйцами в ряд.
Держите яйца гидратированных с небольшим количеством воды системы рыбы. Оттепель Morpholino на льду и подготовить инъекционный раствор так, что 400 пикограмм Morpholino вводится на яйцо с помощью длинного Microloader пипетки отзыв или добавить два-четыре микролитер болюс до конца. Когда все иглы были загружены, используйте типсы, чтобы обрезать избыток длины от иглы советы инъекции и смонтировать первую иглу в микроманипулятор подключен к пиколитер микроинъектора.
Затем поместите инъекционной тарелки под рассечение микроскопа и использовать микроманипулятор, чтобы проникнуть каждое яйцо с иглой, прежде чем вводить один нанолитер Morpholino инъекционный раствор непосредственно в желток. Для инъекций CRISPR смешайте 25 пикограмм направляющих РНК с 300 пикограммами РНК-мессенджера CRISPR-ассоциированного белка 9 и ввилит в каждый эмбрион два нанолитров полученного раствора РНК, как это было продемонстрировано. Для транспозазы Tol2 и фланговой плазмидной инъекции Tol2 объедините 25 нанограммов на микролитер РНК посыльного Tol2 с 25 нанограммами на микролитер плазмидной конструкции Tol2 и феноловый красный в воде без RNase.
Затем ввими один нанолитер раствора в каждый эмбрион, как только что продемонстрировано. Для проверки Morpholino-инъекционных животных в течение четырех дней после инъекции, в зависимости от гена интереса, визуализировать личинки рыб под стерео микроскопом для наблюдения фенотипа инъекционных животных или видеозаписи для измерения поведения. Для проверки инделей CRISPR перенесите в ПЦР эмбрионы, введенные CRISPR, и извлекайте ДНК в соответствии со стандартными протоколами извлечения ДНК для полимеразной цепной реакции или анализа ПЦР.
Для оценки мутагенеза запустите пять микролитров продукта ПЦР на 3%агарозном геле при 70 вольтах в течение трех часов. Дикий тип, не мутагенизированные ДНК приведет к отдельной полосе, в то время как мутант ДНК приведет к smeary полосы. Пещера Mexicanus вводили с контролем Morpholino экспонатов значительно больше локомотивной активности и снижение сна в течение 24-часового периода, по сравнению с поверхностными рыбами вводили с омлетом Morpholino.
Инъекция гипокретина orexin Morpholino имеет мало влияния на сон в поверхностных рыб по сравнению с контролем вводили рыбы. В отличие от этого, гипокретин orexin нокдаун через инъекцию Morpholino оказывает значительное влияние на сон в пещерных рыб, обеспечивая прямую связь между гипокретин orexin выражение и потеря сна. CRPSR-опосредованное mutagenesis гена альбинизма OCA2 в поверхностных рыбах приводит к в некоторых индивидуалах homozygous для одичал-типа OCA2 положительный аллель, и связано с укрывать пигментацию, тогда как индивидуалы которые имеют 2 экземпляра CRISPR-мутировавшего OCA2 отрицательный аллель альбинос, обеспечивая прямую связь между мутантным геном OCA2 и альбинизмом в пещере рыб.
Выберите положительный F0 для Tol2 передаваемого трансгена обратно крест к дикому типу для создания стабильных линий F1. Это позволяет живую визуализацию кальция для выявления различий в активности нейронов, посредничества поведенческих изменений в пещерной среде, закладывая основу для выражения многих дополнительных трансгенов для характеристики и манипулирования функцией генов в A mexicanus. Наиболее важные вещи, чтобы помнить, чтобы загрузить яйца плотно на тарелку, чтобы обрезать иглу должным образом, и оптимизировать микроинъекции.
После успешного генетического нокдауна, трансгенной интеграции или редактирования генов при посредничестве CRISPR эти рыбы могут быть использованы для анализа развития, поведения и активности мозга.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
