从环境样品中筛选高通量的安德森菌: 植物组织、散装土壤和根际土壤

侧泡是低分子量，金属溷合生物分子参与铁循环的环境。该协议允许对土壤和植物样品中的侧罗弗活性进行快速的高通量评估。以往的侧罗磷检测方法消除了微生物群落的关键环境。

我们的技术允许在相对完整的微生物群落及其所参与的栖息地内进行检测。因为铁的可得性对农业生产力至关重要，因此在该协议中，可以使用这种协议来研究微生物在调节铁对植物的可得性方面的作用。此外，这种方法还可用于评估农场管理做法对土壤健康和副产区社区的影响，以及随着时间的推移，这些社区的发展。

首先，酸洗所有玻璃器皿在100毫摩尔盐酸100毫摩尔硝酸至少两个小时之前，在CAS测定使用。准备一个装满实验室级沙子的铝制烤盘，用铝箔盖住它。在121摄氏度下进行30分钟的自动记录，并留出。

通过将 0365 克添加到 20 毫升的双去离子水中，将溶液放在 37 摄氏度的水浴中，以促进溶解，从而准备 HDTMA。将 0302 克 CAS 加入到 25 毫升双脱水中，同时用无菌磁搅拌棒轻轻搅拌。然后将五毫升一摩尔氯化铁六水合物加入 CAS 溶液的 25 毫升，同时继续轻轻搅拌。

现在，在轻轻搅拌的同时，缓慢地将 20 毫升 HDTMA 溶液加入铁 CAS 复合解决方案。通过将 15.12 克 PIPES 溶解到 375 毫升的双脱水中，轻轻搅拌，准备缓冲液。使用五个氢氧化钠将 pH 调节到 6.8。

然后加水，使体积达到450毫升。现在加入五克阿加罗斯溶液。在 121 摄氏度下将 PIPES 缓冲液和铁 CAS 复合解决方案在 121 度下自动保存 30 分钟。

在将每个铁 CAS 复合解决方案自动解处理后，请小心地将其全部添加到生物安全柜中整个 PIPES 缓冲液中。将混合溶液放在 50 摄氏度的水浴中。现在，将无菌试剂船放在生物安全柜内的无菌沙子中，加热至 50 摄氏度。

将铁CAS复合的加糖转移到船上，然后快速将100微升的微升转移到每一孔的透明平底无菌96孔微孔板上。在先前准备的改进型 M9 介质中准备 800 微摩尔皮过丁标准。将溶液稀释为 400、200、100、50、25、12.5 和 6.25 微摩尔解决方案。

将 EDTA 添加到 500 毫升以前准备的修改 M9 介质中，以准备 3.2 毫摩尔 EDTA 标准。将该解决方案稀释为 1600、800、400、200、100、50、25、12.5 和 6.25 微摩尔解决方案。为了生成标准曲线，将每浓度的皮乌弗丁和 EDTA 的 100 微升添加到包含 100 微升铁 CAS 复合汞介质的 96 孔微孔板的井中。

对每个浓度进行重复的技术复制。还要添加仅包含 M9 的空白井。使用微孔板读卡器，在 22 摄氏度下测量 1、6 和 24 小时后的吸光度，并使用吸收度测量生成标准曲线。用22微米滤22滤双脱水清洗取样设备，然后用70%乙醇清洗，然后用纸巾擦拭。

在取样前和样品之间进行洗涤，以保持无菌技术并减少交叉污染。在从田间植物中挖掘出小根球后，将根球放在单独的标记塑料袋中，在实验室环境中进行样品分离。将所有样品直接放在冰上，并保持在4摄氏度，直到样品被处理为侧罗激素生产测定。

将根相关土壤样本分离成散装的、松散边界的根层土壤和紧密边界的根圈土壤。为此，将根球从袋子中拿出来，轻轻甩掉根球的土壤。从土壤中脱落，以及留在袋子里的土壤，构成大土。

这是松散边界的地层土壤。通过用紧密约束的样品根部将它们放在离心管中，生成紧密约束的根质土壤。加入30毫升的双去水，涡流2至3分钟。

去除根部，获得紧密约束的根圈土壤浆料稀释。通过混合和转动土壤，在不打开样品袋的情况下，使样品袋内的每个土壤样本均质。每个样品彻底混合后，在无菌的50毫升离心管中，将每个土壤样品的20毫升中悬浮两克。

稀释样品，然后用无菌泡沫塞密封管，以便进行呼吸。对于紧密绑定的根层样品，在无菌的 50 毫升离心管内将两毫升的根流层土壤浆料添加到 20 毫升的改性 M9 介质中。稀释样品，然后用无菌泡沫塞密封管，以便进行呼吸。

要准备组织样品，表面用70%乙醇对根部、射粒和颗粒进行消毒。在20毫升改性M9介质中，使用高培养粉，在20毫升中搅拌两克新鲜组织，使用30秒。然后，将样品转移到无菌的 50 毫升离心管中，稀释，然后用无菌泡沫塞密封管。

通过铁限制来丰富侧管生产，在室温下孵育50毫升离心管，并在160 RPM转速下摇动。在24、48和72小时后开始浓缩培养，使用无菌技术从富集管中去除1毫升亚样本。在两毫升离心管中以10，000次G将子采样离心一分钟，使细胞产生颗粒。

使用无菌技术，在微孔板内的重复或三分之一的铁 CAS 复合剂 100 微升溶液中加入 100 微升的上液。还添加100微升无菌M9介质作为空白。然后在28摄氏度下孵育板。

每个板在放在培养箱中之前应密封并用铝箔覆盖。将每个样品的剩余上那和颗粒悬浮到其自己的无菌两毫升离心管中。在每个样品上流液管中加入400微升无菌甘油，然后重新悬浮颗粒，形成甘油储存。

将库存冻结在零下 80 摄氏度，供以后分析。在 6、24、48 和 72 小时以 420 纳米波长测量吸光度。伪多莫纳斯荧光素的皮奥弗丁混合物生物合成被用作解释和量化微摩尔中皮奥韦丁等价样品中样品的吸光度的标准。

此处显示了 420 纳米的吸光度与皮多丁起始浓度之间的关系。在48小时孵化时评估了72小时富集的侧罗福活动，以确定基因型和样本型对侧罗磷分离的影响。散装土壤样品中的侧粒活性相对较低，在进行散装土壤取样的小麦基因型之间没有差异。

然而，与马德森和727的松散束缚土壤相比，从725基因型中分离出的松散束缚土壤的富集表现出更大的侧罗磷产量，而不是Lewyjain的松散束缚土壤。相反，从紧密束缚的土壤中浓缩的侧罗磷生产并没有受到基因型的严重影响。无论基因型如何，谷物组织的富集培养产生相对较低的侧粒生成。

与其他基因型相比，Lewjain射枪组织的富集量明显低于侧罗磷产量，725种射向组织培养物导致侧罗激素生产变化更多。在根组织富集培养物中观察到的侧罗激素活性差异最大，其中725的侧罗激素活性比所有其他基因型高200%以上。执行协议最费于一切的方面是保持无菌条件，同时完成生成 CAS 铁腕微孔板的许多步骤，并测试样品进行侧罗磷活性。

广泛的基于色谱培养或基于DNA的技术可以应用于实际的微蒂特井或甘油保存培养，以进行进一步的生化测试或遗传特征和代谢建模。通过使用该协议，侧向性活动以后可以与负责该活动的特定生物体联系，或随后作为更大生态影响的机制。该协议可以很容易地修改，以评估从空气、水和沉积物等其他环境隔间收集的样品中产生的富集培养物中的侧排生产。