Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Provberedning för Mass-Spektrometri-baserad proteomik analys av okulär microvesselsna
Chapters
Summary February 22nd, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Proteomet karakterisering av okulär mikrovaskulära sängar är avgörande för fördjupad förståelse av många okulär sjukdomar hos människor. Denna studie visar en effektiv, snabb och robust metod för protein utvinning och provberedning från små blodkärl som sysselsätter den svin korta bakre ciliära artärer som modell fartyg för mass-spektrometri-baserad proteomik analyser.
Transcript
Beredningen av hög kvalitet massa-spectrometry-kompatibla prover för omfattande proteom analys av okulär prover är avgörande för att klarlägga de molekylära mekanismer och signalering vägar inblandade i hälsa och sjukdom. Det beskrivna arbetsflödet representerar en enkel men robust metod för stränga provberedningssteg som tillgodoses specifikt för analys av massbegränsade prover som okulär mikroblodkärl. Även om det huvudsakliga syftet med studien är att fastställa en MS-kompatibel metodik för okulärblodkärl, kan det beskrivna arbetsflödet i stort sett tillämpas på olika cell- och vävnadsbaserade prover.
Generellt, individer nya till denna metod kan kämpa eftersom identifiering och isolering av den valda kort bakre ciliary artär, eller SPCA grenar, kan vara utmanande. Färska porcine ögon, tillsammans med synnerven och extraocular vävnader, erhölls från den lokala slakteri omedelbart post-mortem. Placera ögat klotet i en dissektion kammare som innehåller iskall Krebs-Henseleit buffert.
Skär försiktigt bort omgivande muskler och vävnader med ett par vassa Mayo sax. Gör ett snitt med en skalpell, och skär globen längs ekvatorialplanet med ett par vassa Mayo sax tills ögat är separerat i främre och bakre halvor. Ta bort så mycket glaskropp som möjligt från den bakre halvan av ögat med hjälp av ett par standardmönster-tutt.
Efter att ha använt dissektion stift för att noggrant stift ner den bakre halvan av ögat, försiktigt skära bort bindväven kring synnerven, att exponera den underliggande retrobulbar vasculature med ett par student Vannas våren sax. Isolera paraoptiska och distala kort bakre ciliary gatan tillsammans med omgivande bindväv med ett par av typ fem precision pincett och Vannas capsulotomy sax. Ta försiktigt bort bindväv från de arteriella segmenten med hjälp av extra fina tippade pincett och sax innan du sköljer de isolerade artärerna i iskalla PBS för att avlägsna föroreningar och blodrester.
Pool artärer från två ögon för att få en biologisk replika, sedan väga proverna med hjälp av en analytisk balans. Till varje rör, tillsätt en blandning av 0,5 och en millimeter zirkonium oxid pärlor följt av vävnad proteinextraktion reagens. Nu, ladda provet rören i en mixer homogenisator.
Ställ in timern på två minuter, ställ in hastighetsnivån på sex och starta homogeniseringen. Efter att ha kört, kontrollera proverna för fullständig homogenisering och hålla prover på is i mellan varje körning. Upprepa cykeln tills proverna är helt homogeniserade.
Försiktigt pipettera homogenate till färska mikrocentrifugrör. Centrifugera proverna vid 10, 000 gånger G i 20 minuter vid fyra grader Celsius till pellet olösliga proteiner. Försiktigt pipettera supernatanten som innehåller de lösliga proteinerna utan att vidröra pelletsskiktet, och överför till färska mikrocentrifugrör.
Lägg till 200 mikroliter av Extraction Buffer 2A och fem mikroliter av proteashämmare cocktail till varje pelletprov. Därefter, suspendera pelleten flera gånger med en pipett. Använd en ultraljudshomogenator för att helt homogenisera pelleten.
Ställ in amplituden på 60 och cykla till en. Använd en sond gjord av titan, vilket är lämpligt för homogenisering av prover med små volymer. Sänk ner sonden i pellet- och extraktionsbuffertblandningen på is, och tryck på startknappen.
Sonikera provet tills pelleten klumpar är helt homogeniserade, pausa i några sekunder mellan varje ultraljudsbehandling. Kontrollera om det finns fullständig homogenisering visuellt. Blanda homogenatet flera gånger med en pipettering för att säkerställa att det inte finns några klumpar.
Använd centrifugalfilterenheter med trekilosdaltons cutoff för denna procedur. Sätt in tre kilodaltons cutoff-filterenheten i ett mikrocentrifugrör. Pipett 200 mikroliter av prov homogenate till en filteranordning, och tillsätt 200 mikroliter av avjoniserat vatten i samma filter.
Efter tak det säkert, placera filterenheten i en centrifug, och snurra för 14, 000 gånger G i 15 minuter vid fyra grader Celsius. Efter centrifugering, separera filterenheten som innehåller provkoncentratet från det mikrocentrifugrör som innehåller filtratet, och då ska filtratet kasseras. Rekonstruera koncentratet genom att tillsätta 400 mikroliter av avjoniserat vatten i filterenheten.
Efter upprepande filtrering tre gånger, försiktigt pipettera den rengjorda provkoncentrat till en ren microtube. Förbered proverna för endimensionell gelelektrofores enligt listan i textprotokollet, och blanda väl med en pipett. Värm proverna vid 70 grader Celsius i en torr blockvärmare i 15 minuter, och kyl till rumstemperatur.
Ladda försiktigt 50 mikrogram prov per fil med hjälp av en pipett, samt den förbestrykande proteinstandarden som en markör för molekylmassa. Kör gelerna i cirka 60 minuter vid en konstant spänning på 175 volt. I slutet av körningen, försiktigt ta bort gelen från kassettplattan med hjälp av en gel kniv, och överföra gelen i en gel färgning låda.
Utför fixering och färgning av gelen enligt beskrivningen i textprotokollet. Skaka gelerna i färgningslösningen över natten för bästa totalresultat. Dekantera försiktigt färgningslösningen och ersätt med 200 milliliter avjoniserat vatten innan du skakar gelerna i minst sju till åtta timmar i vatten för att rensa bakgrunden.
Punktskatter proteinbanden från gelen med rena nya mikrotomblad. Skär bandet i små bitar, och försiktigt överföra gelbitarna i 1,5-milliliter mikrocentrifugrör. Tillsätt 500 mikroliter av avfärgningslösning innehållande 100-millimolar ammoniumbikarbonat och acetonitril.
Inkubera proverna i rumstemperatur i 30 minuter, med enstaka skakningar. Försiktigt pipettera ut avfärgningslösningen. Kontrollera visuellt för alla rör med kvarvarande fläck, och upprepa detta steg om gel bitar fortfarande färgas blå.
Tillsätt cirka 400 mikroliter nyberedd DTT-lösning, och inkubera i 56 grader Celsius i 30 minuter. Efter att reducerande lösning har kasserats med en pipett, tillsätt ungefär 400 mikroliter nyberedd IAA-lösning, och inkubera i mörker vid rumstemperatur i 30 minuter. Ta bort alkyleringsbufferten med en pipett och kassera.
Tillsätt 500 mikroliter av snyggt acetonitril vid rumstemperatur i 10 till 15 minuter, tills gelbitarna krymper och blir ogenomskinliga. Pipett ut acetonitril, och lufttorka gelbitarna i fem till 10 minuter under huven. Sedan pipettera 50 mikroliter trypsinlösning i varje rör för att helt täcka gelbitarna och inkubera rören i fyra grader Celsius.
Efter 30 minuter, tillsätt tillräcklig volym trypsin buffert för att helt täcka gelbitarna om det behövs. Inkubera proverna över natten vid 37 grader Celsius. För att utföra peptidutdragning, försiktigt pipettera den extraherade peptidlösningen från rören och överför till rena mikrorör.
Torka supernatanten i en centrifugalvakuumförångare. Tillsätt 100 mikroliter utsugsbuffert till varje rör med gelbitar, och inkubera i 30 minuter med skakning. Pipettera supernatanten i samma mikrotuber som innehåller de extraherade peptiderna enligt deras respektive band, och torkar ner i en vakuumcentrifug.
Gå vidare till peptidrening och vätskekromatografi-elektrosprayjonisering MS/MS analyser enligt beskrivningen i textprotokollet. Här avbildas den totala mängden proteiner i prover som utvinns med varje typ av tvättmedel. Den högsta avkastningen kom från vävnader som extraherades med vävnadsproteinutvinningsbuffert, följt av DDM, CHAPS, ASB-14 och den lägsta avkastningen från ACN och TFA.
Konsekvent var de totala proteiner som identifierades också de högsta i det vävnadsproteinutvinningsbuffert som extraherades och följde samma trend som den totala avkastningen. Här visas jämförelsen av en-dimensionen gel elektrofores protein profiler av SPCA, före och efter att ha utsatts för optimerad provberedning och rengöring steg. Totalt sett observerades en hög grad av utsmetning och dålig separation av proteinbanden vid körfält tre.
Denna profil visar att proverna kan innehålla extraktionsreagens, och även föroreningar såsom lipider och cellulära skräp. Men de SPCA-prov som separerades till supernatant och pellet, och sedan utsattes för det optimerade protokollet, resulterade i exemplariska endimensionella dimensionerelektroforesprofiler. Den optimerade metoden för snabb, robust och effektiv proteinutvinning från okulär mikrokärl kan också lätt appliceras på andra vävnadsbaserade prover.
Här visas proteinprofiler av supernatanten och pelleten av murinhjärna och hjärtvävnadsprover. Medan du försöker detta förfarande, är det viktigt att komma ihåg att utsätta proverna för fullständig homogenisering, att separera supernatanten från pelleten, och att ta bort föroreningarna och extraktionsreagenserna. Efter dess utveckling banade denna teknik vägen för forskare inom området experimentell och translationell oftalmologi att grundligt utforska proteom av oscular vasculature med porcina ögon som modell.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
