Biochemistry
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Brug af open source-MALDI TOF-MS IDBac-rørledningen til analyse af mikrobiel protein og specialiserede metabolit data
Chapters
Summary May 15th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
IDBac er en open-source massespektrometrisk-baseret Bioinformatik pipeline, der integrerer data fra både intakt protein og specialiseret metabolit Spectra, indsamlet på cellemateriale skrabet fra bakterielle kolonier. Rørledningen giver forskerne mulighed for hurtigt at organisere hundreder til tusinder af bakterielle kolonier i formodede taksonomiske grupper, og yderligere differentiere dem baseret på specialiserede metabolit produktion.
Transcript
IDBac par masse spec data fra protein og specialiserede metabolit regioner af ukendte bakterielle isolater til hurtigt at diskriminere mellem isolater baseret på både deres identitet og deres potentielle miljømæssige funktion. Vores kontor kilde software udvider nytten af eksisterende MALDI TOF baseret mikrobielle identifikation strategier. Denne udvidelse omfatter analyse af specialiseret stofskifte som en yderligere måde at skelne mellem kolonier med lignende fænotyper.
En stor udfordring i at karakterisere ukendte mikroorganismer er at skelne nært beslægtede isolater. IDBac giver forskerne en nem og hurtig måde at karakterisere isolater gennem protein og små molekyle profilering. IDBac giver en visuel sammenligning af specialiseret metabolit produktion inden for en bakteriel prøve og kan give indsigt i en bred vifte af forskningsemner fra økologiske undersøgelser til narkotika bly opdagelse.
Der er mange måder, hvorpå MALDI-data kan gemmes mellem og mellem instrumenter. Hvis du har problemer med at få filer til at fungere med IDBac, skal du sende et problem til IDBac's GitHub. Ved hjælp af en steril tandstikker, overføre en lille del af en bakteriekoloni til det relevante sted på en ren MALDI plade.
Spred bakteriekolonien jævnt over stedet, så stedet fremstår så fladt som muligt. Overlejrer en mikroliter af 70% massespektrometrikvalitet myresyre på prøven og matrix kontrol pletter og lad syren til lufttørre i en kemisk røg hætte. Dernæst tilsættes en mikroliter af tidligere tilberedt MALDI matrixløsning til prøve- og matrixmediekontrolpunkterne og lad det lufttørre helt.
Efter opsætning af MALDI TOF massespektrometeret, erhverve spektre. Gem proteinspektre i en mappe og den specialiserede metabolitspektre i en anden separat mappe. Hvis du vil starte denne procedure, skal du hente IDBac-softwaren.
Dobbeltklik på den hentede install_idbac for at starte installationsprogrammet. Dobbeltklik derefter på iDBac-skrivebordsgenvejen for at starte IDBac, som som standard åbnes under introduktionsfanen. Klik på fanen Start med rå data, og vælg fra menuen Opret et IDBac-eksperiment den type data, der skal bruges sammen med IDBac.
Når du konfigurerer konvertering og behandling af datafiler, skal du indtaste et beskrivende navn til eksperimentet, hvor du bliver bedt om det, og klikke på rådatamappen og vælge den relevante mappe. Klik derefter på Procesdata. Når du har konverteret filerne og behandlet dem med IDBac, skal du navigere til siden arbejde med tidligere eksperimenter og vælge et eksperiment, du vil arbejde med.
Tilføj oplysninger om eksempler ved hjælp af menuen klik her for at ændre det valgte eksperiment. Indtast oplysninger i det autobefolkede regneark, og tryk på Gem. Når du er klar til at starte analysen, skal du sikre dig, at det eksperiment, du skal arbejde med, er valgt.
Vælg derefter proteindataanalyse. På proteindataanalysesiden skal du vælge de toppede indstillinger og evaluere proteinspektre af prøver via de viste spejlområder. Juster den procentdel af replikater, hvori der skal være en top, for at den kan medtages til analyse.
Brug spejlet plots som visuel vejledning, justere signalet til støj cutoff, der bevarer de mest ægte toppe og mindst støj at mærke, at flere replikater i en højere procentdel peak tilstedeværelse værdi vil give mulighed for valg af et lavere signal til støj cutoff. Derefter angives den nedre og øvre masse for at oplade afskæringer, der dikterer masseværdierne inden for hvert spektrum, der skal anvendes i yderligere analyse af IDBac. På siden med analyse af proteindata skal du vælge fanen Dendrogram for at give mulighed for at gruppere prøver i et dendrogram i henhold til bruger valgte afstandsforanstaltninger og klyngealgoritmer.
Klik på udvalgte eksempler i menuen, og følg vejledningen for at vælge eksempler, der skal medtages i analysen. Kun prøver, der indeholder proteinspektre, vil blive vist i den tilgængelige prøveboks. Brug standardværdierne for fjern- og klyngealgoritmer, og vælg intensiteter som input.
Hvis du vil have vist bootstrap-værdierne på dendrogram, skal du indtaste et tal mellem to og 1.000 under bootstraps. For at begynde at tilpasse dendrogram, skal du åbne justere dendrogram menuen. Hvis du vil farvelægge dendrograms linjer, skal du markere Klik for at ændre linjer og vælge de ønskede indstillinger.
Hvis du vil afbilde oplysninger fra regnearket ved siden af dendrogram, skal du vælge knappen indarbejde info om prøver. Dette åbner et panel, hvor en kategori udfyldes selv baseret på de angivne værdier. Hvis du vil indsætte eksempler fra et andet eksperiment, skal du vælge menuknappen indsætte prøver fra et andet eksperiment og følge anvisningerne i det nyåbnede panel.
Fortsæt til den lille molekyle dataanalyse side for at muliggøre data visualisering af princippet komponenter analyse og metaboliske forening netværk, der bruger topartsnetværk til at vise korrelationen af små molekyle masse til at oplade værdier med prøver. Klik og træk på dendrogram at fremhæve udvalgte prøver af interesse, der skal analyseres. Hvis der ikke fremhæves nogen prøver, eller der ikke er oprettet proteindedrogram, vises et metabolitforeningsnetværk af enten et tilfældigt undersæt eller alle prøver.
Hvis du vil trække et blindt matrixmedie i metabolittilknytningsnetværket, skal du åbne menuen og vælge et eksempel for at trække og vælge det relevante eksempel, der skal bruges som en tom. Åbn menushow/skjul MAN-indstillingerne for at vælge de ønskede værdier for en procentdel af spidsbelastning og replikere, signal til støj og øvre og nedre masseafskæringer. Brug de små molekyle spejl plots til at guide udvælgelsen af disse indstillinger.
For rapportering af resultater skal du kopiere teksten i afsnittet med forslag til rapportering af MAN-analyse for at angive de brugerdefinerede indstillinger, der bruges til at generere oprettet metabolisk tilknytningsnetværk. Seks stammer af Micromonospora chokoriensis og to pletter af Bacillus subtilis blev analyseret ved hjælp af data i IDBac software. Følgende anvisninger i starten med rå data fanen, mulighed klik her for at konvertere Bruker filer blev valgt, og IDBac forudsat instruktioner blev fulgt for hvert datasæt.
Til den automatiserede konvertering og pre-processing peak peaking trin, en kombineret IDBac eksperiment blev skabt ved at overføre Bacillus og Micromonospora prøver fra de to eksperimenter i et enkelt eksperiment. Den resulterende analyse omfattede sammenligning af proteinspektre ved hjælp af spejlområder, som var nyttige til vurdering af spektrekvalitet og justering af spidsbelastningsindstillinger. Et skærmbillede af resultaterne af proteinklynger med valgte standardindstillinger vises her.
Dendrogram var farvet ved at justere tærsklen på plottet. Det skal bemærkes, at den klare adskillelse mellem slægter med både M.chokoriensis og B.subtilis isolerer klyngedannelse separat. Ved at klikke og trække hen over protein dendrogram, var det muligt hurtigt at skabe metaboliske forening netværk til at sammenligne kun B.subtilis stammer, kun M.chokoriensis stammer, og alle stammerne samtidigt.
Den primære funktion af disse netværk er at give forskerne et bredt overblik over graden af specialiserede metabolit overlapning mellem bakterier. Når du arbejder med nye data, skal du bruge IDBac's spejl plots for at sikre, at dine data giver mening og spektre er af høj kvalitet. Kritisk evaluere dit eksperimentelle design og resultater på hvert trin.
IDBac giver forskerne mulighed for at bygge små og forskelligartede biblioteker af mikroorganismer til yderligere undersøgelse. Dette reducerer i høj grad omkostningerne forbundet med traditionelt store og overflødige mikrobielle biblioteker. Da IDBac giver dig mulighed for at visualisere specialiseret metabolitoverlap inden for meget lignende fylogenetiske grupper, kan det bruges til at generere forskningsspørgsmål og hypoteser, der forbinder to typisk afbrudte felter.
Myresyre er ætsende og bør håndteres i en kemisk røghætte. Nogle miljøisoler kan udgøre potentielle sundhedsfarer, og alle stammer bør behandles som biosikkerhedsniveau to.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
