Cancer Research
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患者衍生的人类泌尿细胞癌和结肠直肠癌肿瘤生长和自发转移的正交异种移植模型
Chapters
Summary May 12th, 2019
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该协议描述了患者衍生的正交异种移植模型,通过内在灌输高级尿细胞癌细胞或直肠内注射结肠直肠癌细胞到非肥胖糖尿病/严重组合免疫缺陷(NOD/SCID)小鼠原发性肿瘤生长和自发转移在淋巴结基质细胞的影响下,模拟人类转移性疾病的进展。
Transcript
需要模型一致需要通过与淋巴结的相互作用来模拟癌症转移。在结肠直肠癌和膀胱尿道细胞癌的患者。本文中描述的正交异种学模型可以帮助回答这些重要的生物问题，并以临床相关的方式有效地测试新疗法。
我们在小鼠身上产生的正畸形肿瘤与患者的肿瘤相似。在淋巴结频闪细胞的存在，两个模型有更高的肿瘤植入和遥远的器官转移率和位置，模仿人类转移模式。此外，两种动物模型的死亡率为零。
从安乐死小鼠身上取出患者衍生的肿瘤后，使用灭菌手术剪刀在层流罩下的培养皿中尽可能小地切碎荧光素酶阳性肿瘤片。将肿瘤片段转移到无菌的 50 mL 锥形管中。要准备消化溶液，加入10毫升的胶原酶4型，80微升的海卢罗尼达塞和160微升的脱氧核糖核酸酶类型1至40毫升的HBVSS，通过倒置混合。
加入35-40 mL的消化溶液，在37摄氏度下孵育，连续旋转2小时，定期剧烈摇晃。为了在消化后清除碎屑，通过无菌的100微米细胞过滤器过滤消化的肿瘤，然后通过40微米细胞滤株过滤，每次在50 mL管中保存流经，并丢弃碎屑。要清洗自由细胞，在流中加入20 mL的HSSS，并在重力329倍时离心5分钟。
吸制上一液，在30 mL的HSS中重新暂停颗粒。将10万个肿瘤细胞转移到无菌的15mL锥形管中，并加入30万个以前准备的新鲜HK细胞。将细胞在重力为329倍的离心5分钟，通过吸气丢弃上一代。
将细胞重新用完整的RPMI介质重新暂停，并一直放在冰上，直到准备好使用。要准备动物的 UCC 细胞注射使用脱毛霜剃光 6-8 周大女性 NOD-SCID 小鼠的下背部。为了将 UCC 细胞管理到膀胱中，首先设置一台功率为 4 瓦的单极电化机。
麻醉鼠标后，将其放在超平位置，用鼻子放在异氟兰鼻锥中，裸露的背部牢固地固定在分散的电极上。用润滑果冻润滑 24 量表血管导管，然后轻轻地通过鼠标尿道插入血管导管。如果导管在进入时弯曲，则将导管导线插入导管的半路上，以提供稳定性。
然后，完全插入0.64毫米固定芯直导丝1毫米过去血管导管的端。将单极销固定在导丝上一秒钟，从而对膀胱粘膜进行电刺激。将新鲜、无菌血管导管连接到 1 mL leur 锁注射器，并绘制在前几步中准备的多达 200 微升的 UCC 细胞。
从尿道上取下导管和血管导管，然后用附着在尿道上细胞注射器插入血管导管。将50微升细胞注入小鼠膀胱，让细胞粘附在膀胱壁上，等待几秒钟后取出血管导管。最后，将鼠标从异氟兰鼻锥和接地垫上取下，并在检查后观察1小时，以发现遇险迹象。
要创建CRC小鼠模型，请将麻醉的6-8周大雄性NOD-SCID小鼠置于解剖显微镜下，用胶带固定鼻孔和异氟兰鼻锥和前肢，实现稳定性。将小物体（如小纱布部分）放在尾部底部，提升射头，以提高其可视觉性和角度。使用弯曲润滑的钝尖钳扩张肛门管，露出直肠肛门和直肠粘膜并清除粪便。
将无菌 30 表可拆卸针头连接到 50 微升玻璃注射器。将肿瘤和HK细胞悬浮液的10微升绘制到注射器中。将10微升注入肛门管上方1-2毫米的直肠后侧亚莫科萨，确保不进入骨盆腔。
最后，将鼠标从异氟兰鼻锥中取出，并在手术后观察一小时，以发现遇险迹象。要每周监测原发性肿瘤、肝肺转移性负担，在任一小鼠模型中，首先称重小鼠。在体内注射150毫克/千克荧光素，等待5分钟，让基板在体内循环。
将麻醉小鼠放在生物发光成像系统中，鼻子固定在鼻锥上，确保动物的腹侧区域（动物的腹侧）对着相机拍摄每个图像。每周将鼠标以超平位置显示，用于荧光素酶活性。切片和染色石蜡嵌入的分离组织后，使用高功率显微镜观察它们。
在 UCC 小鼠模型中，83.3% 的动物生成原发性肿瘤，并基于每周生物发光测量显示时间依赖原发肿瘤生长。在CRC小鼠模型中，96.9%的小鼠生长原发性肿瘤。根据患者肿瘤的不同，小鼠肿瘤的生长具有不同的潜伏期，反映了患者临床特征的差异。
在囊泡内和直肠内模型中，肿瘤细胞注射产生正畸原发性肿瘤。此外，分别有33.3%和53.1%的小鼠与UCC细胞和带HK细胞的CRC细胞一起出现远距离器官转移。将 UCC 模型中异种移植的异种移植的异种移植体病理学与原发性患者膀胱癌进行比较。
异种移植物的染色结果与原始手术活检的结果相似，证实了类似的组织形态。Ki67抗体，一种人类细胞增殖标记物，显示积极的核染色表明高度增殖，快速生长的人类肿瘤细胞。同样，在CRC模型中，H&E染色表明异种移植和患者肿瘤之间的结构相似性。
针对细胞蛋白20的抗体染色在两个CRC模型中也表现出类似的肿瘤生长模式。这些程序的关键是温柔，但坚定地对待动物。用稳定的手练习是安全地执行这些技术并取得最佳效果的最佳方法。
一旦这些模型被制作出来，可以测试多种不同形式的癌症疗法，包括当前药物的组合以及患者临床试验之前新开发的疗法。重要的是要记住，癌细胞和针头的处理应该由有经验的人员进行，以确保他们的安全，以及达到最佳的结果。
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