Login processing...

JoVE Journal
Neuroscience

A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.

JoVE Journal Neuroscience

Konvektion forbedret levering af Optogenetic adeno-associeret viral vektor til cortex af rhesus Macaque under vejledning af online MRI-billeder

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Journal (Neuroscience)

Measuring and Altering Mating Drive in Male Drosophila melanogaster

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Journal (Neuroscience)

Using Linear Agarose Channels to Study Drosophila Larval Crawling Behavior

Click here for the English version

Konvektion forbedret levering af Optogenetic adeno-associeret viral vektor til cortex af rhesus Macaque under vejledning af online MRI-billeder

Article DOI: 10.3791/59232-v

May 23rd, 2019 •

Karam Khateeb^1,2, Devon J. Griggs^2,3, Philip N. Sabes⁴, Azadeh Yazdan-Shahmorad^1,2,3,4

¹Departments of Bioengineering, University of Washington, ²Washington National Primate Research Center, ³Department of Electrical and Computer Engineering, University of Washington, ⁴Department of Physiology and Center for Integrative Neuroscience, University of California, San Francisco

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

May 23rd, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Her viser vi magnetisk resonans (MR)-guidet konvektion forbedret levering (CED) af virale vektorer i cortex som en effektiv og forenklet tilgang til opnåelse af optogenetisk udtryk på tværs af store kortikale områder i makak hjernen.

Transcript

Konvektion forbedret levering, eller CED, af optogenetiske virale vektorer i ikke-menneskelige primater vil gøre det muligt for forskere at manipulere neurale aktivitet i stor skala til at forstå komplekse neurale beregninger og adfærd. Med CED kan vi opnå et højt optogenetisk udtryk på tværs af store regioner af primathjernen med kun få injektioner på kort tid sammenlignet med traditionelle metoder. Magnetisk resonans eller MR-kompatibel kammerimplantatation udføres ved hjælp af standardpraksis i ikke-menneskelige primatoperationer, proceduren er beskrevet i detaljer i tekstprotokollen og skitseret kort i denne video.

Efter dyrs sedation, positionering og indledende snit som beskrevet i tekstprotokollen, skabe en cirkulær kraniotomi til at dække de forplanlagte baner for injektioner ved hjælp af en trephine. Opret en indrykning i midten af den planlagte kraniotomi tilstrækkeligt dybt i kraniet til at forankre trephine ved hjælp af trephins justerbare midterpunkt. Når midten er gjort, sænke trephin på kraniet og rotere trephin med uret og mod uret, mens du anvender nedadgående tryk, indtil knoglehætten kan fjernes med syrbånd.

Efter at have løftet duraen som beskrevet i tekstprotokollen, klippes duraen fra midten til kanten af kraniotomien og fortsætte langs kanten med fin oftalmisk saks. Monter den cylindriske specialfremstillede konvektion forbedret levering MR kompatibelt kammer til kraniet på toppen af kraniotomien for at give kanylestøtte under infusion, således at krumningen af kammerflangen flugter godt med kraniets krumning. Fastgør implantaterne til kraniet ved hjælp af enten plast skruer og dental akryl eller et par titanium skruer.

Snart efter implantering af MR kompatibel kammer og indsætte kanyle injektion gitter i kammeret, fylde nettet med 0,9% saltvand til visualisering af injektion steder via MR anatomiske billeder. Også fylde kammeret hulrum med våde sterile absorberbare gel skum til at opretholde fugten i hjernen. Dæk huden og cylinderen med en steril antimikrobiel incise drapere for at opretholde cylindrenes sterilitet under transport og MR-infusioner.

Anse en vitamin E-kapsel for at markere toppen af injektionsgitteret for positiv identifikation. Mens dyret forbliver intuberet, løslad endotrakeal røret fra anæstesi kredsløb og sæt det på en bærbar MR kompatibel isoflurane maskine. Transporter dyret til MR-scanneren.

Ansk af dem T1-billeder for at beregne afstanden fra toppen af injektionsnettet og den kortikale overflade. Vitamin E-kapslen er tydeligt synlig i T1-billeder og bør bruges som markør for toppen af injektionsgitteret. Ansk af dem T2-billeder for at bestemme de optimale kanylevejledninger for hvert sted baseret på det målrettede infusionssted.

Kanylegitteret er fyldt med saltvand, som er bedst synlig i T2-billeder. Brug MR imaging software, rulle gennem koronale og sagittal fly for at finde målet placering af infusion. Efter optøning af den virale vektor i et par timer ved stuetemperatur, bland den virale vektor med MR kontrast agent gadoteridol ved pipette eller vortex blanding.

Den blandede virus indlæses i 0,2 milliliter højtryks IV-slanger. Ved hjælp af højtryks IV slanger, tilslut en lang forlængerlinje til en MR kompatibel tre milliliter sprøjte og prime med saltvand. Tilslut den anden ende af den lange forlængerslang til 0,2 milliliter IV-slangen, der er læsset med virus.

Fastgør derefter den refluksresistente kanyle med en 1 milliliter trinspids til den distale ende af denne samling med et klemisk kateterstik. Sæt endelig sprøjten i en MR-kompatibel pumpe. Ved hjælp af de opnåede baseline anatomiske MR-billeder skal du vælge den placering af kanyleinjektionsgitteret og indføringsdybden, der er nødvendig for at nå målinfusionsstedet.

Marker indføringsdybden på kanylen med steril tape. Infusionen påbegyndes med en hastighed på en mikroliter pr. minut, og væskestrømmen i infusionslinjen valideres visuelt ved at observere udslyngningen af væske fra kanylespidsen. Sæt kanylen manuelt gennem injektionsgitteret til måldybden, samtidig med at strømmen opretholdes i infusionslinjen, da dette vil forhindre det gennemtrængende væv i at tilstopning af kanylen under indføring.

Nu erhverve hurtig flash T1-vægtede billeder til online overvågning af den virale vektor infusion. Efter infusion af ca. 10 mikroliter af vektoren, således at der er infunderet nok virus til at detektere i MR-scanneren, skal du anskaffe MR-billeder for at kontrollere korrekt kanyleplacering som tydelig ved den observerede spredning af virus. Hvis dybden af den indsatte kanyle er forkert, justeres dybden i overensstemmelse hermed eller fjernes langsomt kanylen, og indsætningen skal forsinkes igen.

Overvåg infusionen via vejledning af online MR-billeder. Forøg infusionshastigheden til fem mikroliter pr. minut med en mikroliter pr. minut med få minutters mellemrum. Det er vigtigt at øge infusionshastigheden langsomt og ikke at overstige fem mikroliter pr. minut, da høje infusionsrater kan forårsage vævsskader.

Efter infusion af ca. 40 mikroliter af den virale vektor, begynde at reducere infusionshastigheden med en mikroliter pr. minut trin. Stop infusionen, når der er injiceret ca. 50 mikroliter. Lad kanylen være på plads i ti minutter.

Fjern langsomt kanylen fra hjernen og gå videre til næste sted. Dæk cylinderen med en steril drapere i slutningen af injektioner før dyretransport, derefter transportere dyret tilbage til operationsstuen. Histologiske analyser af serielle koronale sektioner afslører storstilet optogenetiske udtryk omkring infusionssteder.

Vist her er baseline koronale MR billede og spredningen af kontrastmidlet efter infusionen for samme MR koronale skive. En koronal væv sektion er vist fra omtrent det samme. Peroxidase farvning afspejler udtryk for det gule fluorescerende protein eller EYFP reporter.

God tilpasning er observeret mellem arealet af EYFP udtryk, målt med overflade epifluorescense og med histologisk farvning. Disse omfatter regionen vektor spredning anslået fra MR-billeder. Hvide prikker angiver injektionssteder, og hele den sorte region repræsenterer det område, der er udsat for kraniotomien.

Vist her er en lav forstørrelse billede af koronale sektioner farves med anti GFP antistof viser den mediale laterale aspekt af YFP udtryk i somatosensoriske cortex. Den sorte pilespids angiver placeringen af kanylesporet. Det tilstødende væv er vist ved større forstørrelse for at vise laminar fordeling af YFP positive celler.

Tætbefolkede områder af YFP-positive celler er placeret overvejende i lag to til tre og fem til seks. Yderligere udvidelse afslører typiske pyramideceller i lag to til tre, lag fem og lag seks. Det er vigtigt at lade kanylen være på plads i 10 minutter, efter at strømmen er stoppet.

Dette vil sikre, at virussen har percolated i det omgivende målrettede neurale væv. CED er en effektiv tilgang til at opnå ensartet høje udtryksniveauer på tværs af store hjerneregioner hos pattedyr. Det har potentiale til at udvide vores forståelse af neurale kredsløb og tilslutningsmuligheder.

Efter viral transduktion af CED, efterfølgende optogenetiske stimulation eksperimenter kan parres med elektrisk optagelse og adfærdsmæssige essays til at afsløre den komplekse kredsløb dynamik i hjernen. Denne teknik har tidligere været ansat af Yazdan-Shahmorad og kolleger i 2018, hvor optogenetisk neuralmodulering blev brugt til at fremkalde netværksdækkende forbindelsesændringer i den sensoriske motoriske cortex.

X

Simple Hit Counter