Neuroscience
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Utilisation de l'enregistrement in vivo à fibre unique et du ganglion de racine dorsal intact avec le nerf sciatique attaché pour examiner le mécanisme de l'échec de conduction
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Summary August 27th, 2019
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L'enregistrement à fibre unique est une technique électrophysiologique efficace qui s'applique aux systèmes nerveux central et périphérique. Avec la préparation du DRG intact avec le nerf sciatique attaché, le mécanisme de l'échec de conduction est examiné. Les deux protocoles améliorent la compréhension de la relation du système nerveux périphérique avec la douleur.
Transcript
L’enregistrement d’une seule fibre joue un rôle important dans l’enregistrement des activités des fibres nerveuses. En particulier les activités transmettant la sensation périphérique des champs réceptifs aux neurones dans le ganglion de racine dorsale. Dans wavel de l’enregistrement de fibre, fournit la durée du temps avec la capacité d’enregistrer des réponses aux stimulus de nature, et a été plus tard la perturbation de l’environnement intercellulaire.
Dans un enregistrement de fibre unique nécessite neutron automatique bon pour la situation. Le thérapeute appelle l’exigence pour la préparation des essais intégrés de DRG le nerf sciatique est intégré. Le résultat de la situation de démonstration montre presque tous les détails des nerfs en bon stade de décalque physique.
Et troisièmement, toute la préparation DRG comme sont intégrés. Pour commencer cette procédure, préparez et désinfectez tous les instruments chirurgicaux avant la chirurgie. Ensuite, préparez un à deux litres de solution extracellulaire normale de Ringer et rangez-les à quatre degrés Celsius jusqu’à utilisation.
Pour exposer le tronc nerveux sciatique pour l’enregistrement, d’abord, couper la peau du rat anesthésié et les muscles sur la partie dorsale de la cuisse. Ensuite, effectuez une dissection émoussée le long des biceps fémoraux. Isoler soigneusement le tronc nerveux sciatique à l’aide de ciseaux ophtalmiques et d’une aiguille de séparation en verre, et garder le tissu humide à l’aide de la solution de Ringer.
Ensuite, fixez l’animal sur un cerceau en métal fait maison en cousant la peau dans la fente autour d’elle. Tirez légèrement la peau vers le haut pour établir un bain fluide. Exposer un centimètre de tronc nerveux sciatique sur le côté proximal.
Placez une petite plate-forme brune sous le tronc nerveux pour augmenter le contraste afin d’observer clairement le tronc nerveux fin. Par la suite, appliquez de la paraffine liquide chaude sur le dessus du tronc nerveux pour éviter le séchage de la surface de la fibre. Retirez le liquide s’il y a une exsudation autour du tronc nerveux.
Pour effectuer l’enregistrement, sélectionnez le filament platine comme électrode d’enregistrement. Mangez et créez un petit crochet à la toute fin. Ensuite, attachez l’électrode à un micromanipulateur.
Dans le bain, placez une électrode de référence à côté du tissu sous-cutané. Fendre le dura rachidien et le Pia mater et obtenir le nerf sciatique. Sous un stéréo microscope à 25% grossissement, ramasser un fascicle fin et suspendre l’extrémité environroximale de l’axon sur le crochet de l’électrode d’enregistrement.
Identifier le champ réceptif d’une seule fibre c non conceptive à l’aide d’un simulis mécanique et d’un stimulus thermique. Si le tir de la fibre nerveuse répond aux stimuli mécaniques et à l’eau chaude, alors considérez-le comme une fibre c polymotrice et non conceptive. Ensuite, insérez deux électrodes de stimulus d’aiguille avec un intervalle de deux millimètres dans la peau du champ d’identification pour la livraison des stimulus électriques.
Affichez la forme d’onde d’un potentiel d’action sur l’oscilloscope, et employez un ordinateur un d-board avec un taux d’échantillonnage du signal de 20 kilohertz. Ensuite, enregistrez les pointes à l’aide d’un logiciel d’acquisition de données et analysez-les plus tard avec un logiciel professionnel. Pour mesurer la défaillance de conduction, livrer les stimuli répétitifs d’électrode dans différentes fréquences à une fibre c pendant 60 secondes.
Prévoyez un intervalle de 10 minutes pour que la fibre se détende entre les stimuli. Ensuite, calculez le rapport entre le nombre de défaillances et le nombre d’impulsions de stimulus répétitives livrées et multipliez par 100 % pour obtenir le degré de défaillance de conduction. Pour exposer le ganglion de racine dorsale, coupez d’abord la peau de la ligne médiane du dos au segment l4 à l5.
Ensuite, enlever les muscles de la colonne vertébrale processus vertébral bor et processus transversaux à l’aide d’un rongeur d’os, et d’exposer le corps de la moelle épinière NDRG. Couvrez la moelle épinière exposée, NDRG, de coton imbibé de la solution extracellulaire normale de Ringer pour maintenir l’activité neuronale. Arrêtez le saignement et retirez le sang au besoin.
Par la suite, à l’aide de ciseaux ophtalmiques, enlever la structure osseuse l4 à s1 au-dessus du foramen vertébral afin d’exposer le DRG et le nerf spinal relié. Faire une coupe sur la peau pour exposer le nerf sciatique à la cuisse centrale. Séparez et déconnectez le nerf sciatique de l’extrémité distale du nerf où il va à l’intérieur du muscle.
Et ligate le tronc nerveux avec la ligne chirurgicale à l’extrémité du nerf avant de couper. Ensuite, séparez le nerf sciatique du tissu conjonctif sous-jacent en soulevant le point de ligature nerveuse. Retirer le dura de la moelle épinière et séparer le DRG du tissu conjonctif sous-jacent jusqu’à ce qu’il atteigne la partie adjacente du nerf sciatique.
Ainsi, isoler toute la préparation de DRG avec un nerf sciatique attaché. Pour dégager la surface du DRG, au grossissement 4x, retirez soigneusement le dura spinal à la surface de l4 à l6 DRG à l’aide d’une pince à épiler. Placez le DRG avec le nerf sciatique attaché dans un tube en verre contenant un millilitre d’enzymes mélangées.
Digérer dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant 15 minutes. Après 15 minutes, soulevez l’extrémité de la ligne chirurgicale et déplacez la préparation à un plat rempli de la solution extracellulaire normale de Ringer pour laver l’enzyme. Ensuite, transférez le DRG digéré dans un récipient rempli de solution extracellulaire de Ringer oxygénée pour l’enregistrement.
Pour effectuer l’enregistrement, préparez la solution intracellulaire et rangez-la à zéro degré Celsius jusqu’à utilisation. À l’aide d’une ancre de tranche, stabiliser les ganglions et connecter l’extrémité nerveuse à une électrode stimulante par aspiration. Au grossissement 40x, visualisez et sélectionnez un neurone DRG avec un objectif d’emersion d’eau.
Pliez une électrode et remplissez-la de solution intracellulaire. Attachez l’électrode sur le support, et appliquez une pression positive dans le pipet avec une résistance finale de quatre à sept mégaohms. Ensuite, apportez l’électrode à la surface de la cellule.
Ensuite, appliquez une pression négative sur la pipet pour former un joint. Une fois qu’un joint gigaohm est atteint, réglez le potentiel de la membrane à environ moins 60 millivolts et établissez tout le mode d’enregistrement cellulaire. Par la suite, livrer des stimuli répétitifs de 5 à 50 hertz au nerf sciatique à travers l’électrode d’aspiration à l’écran pour l’échec de conduction.
Mesurer l’amplitude de l’AHP de la ligne de base au pic et la durée de 80% AHP. Ce chiffre montre les enregistrements consécutifs originaux de re-tirs c5 simples de rats en réponse à la stimulation électrique de 10 hertz. Chaque vingtième balayage est montré et affiché de haut en bas.
L’insert montre un potentiel d’action représentatif. Voici les enregistrements de fibres c simples provenant de rats injectés par CFA en réponse à la même stimulation que le panneau précédent. Ce chiffre montre les enregistrements continus des réponses de tir en série à cinq stimulations hertziques dans des conditions de contrôle, ou l’administration de différentes concentrations de ZD7288 dans un neurone DRG de petit diamètre provenant de rats classés CFA.
Les insets montrent des traces étendues pour les périodes d’enregistrement spécifiées. Les taches sombres représentent des défaillances des pointes. L’AHP a montré une plus grande pente montante dans le contrôle.
Alors qu’une pente ascendante plus petite a été observée après 125 micromolaires à l’application ZD7288. Quand un enregistrement de cinq fois simple, je pense qu’il est important de couper la fibre gardera les animaux est bon n’importe quelle condition de sécurité. Et microenvironnement autour du neutron.
La combinaison de l’enregistrement simple de fibre et de l’application du DRG intact attaché avec le nerf sciatique, a amélioré notre compréhension du système nerveux périphérique se rapportant à la douleur.
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