Neuroscience
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पूर्व इकट्ठे प्लास्टिक Microfluidic चिप्स के भीतर मानव स्टेम सेल व्युत्पन्न न्यूरॉन्स के compartmentalization
Chapters
Summary May 3rd, 2019
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इस प्रोटोकॉल commentalized microfluidic चिप्स के उपयोग को दर्शाता है, मानव स्टेम कोशिकाओं से विभेदित सुसंस्कृत न्यूरॉन्स के लिए एक चक्रीय olefin copolymer में ढाला इंजेक्शन. इन चिप्स preassembled और आसान करने के लिए उपयोग पारंपरिक commentalized पाली (dimethylsiloxane) उपकरणों की तुलना में कर रहे हैं. एकाधिक आम प्रयोगात्मक प्रतिमान यहाँ वर्णित हैं, वायरल लेबलिंग सहित, fluidic अलगाव, axotomy, और इम्यूनोस्टेनिंग.
Transcript
कंपार्टमेंटल माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस न्यूरॉन्स को उनके अत्यधिक ध्रुवीकृत रूप में अध्ययन करने की अनुमति देते हैं। ये उपकरण बुनियादी और अनुवाद तंत्रिका विज्ञान अनुसंधान दोनों के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाते हैं। यह प्रोटोकॉल मानव स्टेम कोशिकाओं से विभेदित न्यूरॉन्स को विभाजित करने के लिए चक्रीय ओलेफिन कोपॉलिमर चिप्स का उपयोग कैसे करें, इसका वर्णन करता है।
ये सीओसी चिप्स पीडीएमएस बहु-डिब्बे उपकरणों पर विभेदित न्यूरॉन्स की स्वस्थ संस्कृतियों का उत्पादन करते हैं। इस प्रोटोकॉल में, हम एनआईएच-अनुमोदित एच9 स्टेम सेल लाइन से विभेदित न्यूरॉन्स की संस्कृति को प्रदर्शित करते हैं। इसी तरह की प्रक्रियाओं का उपयोग mIPSCs से न्यूरॉन्स को अलग करने के लिए किया जा सकता है।
बहु-डिब्बे चिप्स को अतिरिक्त आर्द्रीकरण के साथ माध्यमिक रोकथाम में रखा जाना चाहिए। बहु-डिब्बे चिप्स के चैनलों को प्रीकोट समाधान से भरा जाना चाहिए, और फिर पीबीएस के साथ फ्लश किया जाना चाहिए। शुरू करने के लिए, सेल कल्चर ग्रेड आसुत पानी में पॉली-एल-ऑर्निथिन को भंग करने के लिए प्रति चिप समाधान के 600 माइक्रोलीटर बनाने के लिए।
शेष पीबीएस को कुओं से हटा दें, जिससे यह सुनिश्चित हो सके कि पिपेट टिप चैनल खोलने से दूर है। ऊपरी दाईं ओर अच्छी तरह से पॉली-एल-ऑर्निथाइन वर्किंग सॉल्यूशन के 150 माइक्रोलीटर लोड करें। 90 सेकंड के लिए प्रतीक्षा करें और निचले दाईं ओर समाधान के 150 माइक्रोलीटर जोड़ें।
पांच मिनट रुको और बाएं कुओं के लिए समाधान के साथ लोडिंग प्रक्रिया दोहराएं। फिर, रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर चिप के साथ ह्यूमिडिफायर ट्रे रखें। अगर पेट्री डिश का इस्तेमाल कर रहे हैं तो इसे पैराफिल्म के साथ लपेटकर रात भर चार डिग्री सेल्सियस पर रखें।
इसके बाद, कुओं से समाधान को एस्पिरेट करें, यह सुनिश्चित करते हुए कि पिपेट टिप को चैनल खोलने से दूर रखा गया है। और दो बार बाँझ पानी के प्रत्येक १५० माइक्रोलीटर के साथ सही और बाएं कुओं लोड िंग दोहराएं । लैमिनिन वर्किंग सॉल्यूशन तैयार करें।
150 माइक्रोलीटर के साथ दाएं और बाएं कुओं को लोड करें प्रत्येक लेमिनिन वर्किंग सॉल्यूशन। 37 डिग्री सेल्सियस पर दो घंटे के लिए ट्रे के भीतर चिप इनक्यूबेट। कैल्शियम और मैग्नीशियम के बिना पीबीएस के साथ चिप कुल्ला।
पीबीएस के प्रत्येक 150 माइक्रोलीटर के साथ दाएं और बाएं कुओं को लोड करें। पांच मिनट इंतजार करें। पीबीएस को कुओं से नीचे गिराकर चिप को एनएससी मीडिया से खंगाल डाला।
150 माइक्रोलीटर एनएससी मीडिया के प्रत्येक के साथ दाएं और बाएं कुओं को लोड करें। चिप को प्री-कंडीशन करने के लिए 5% CO2 के साथ 37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर में रात भर ट्रे में चिप को इनक्यूबेट करें। मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं को बहु-डिब्बे चिप में बीज करने के लिए, पहले हीमोसाइटोमीटर का उपयोग करके सेल एकाग्रता की गणना करें।
इसके बाद मीडिया को कुओं से जाता है। ऊपरी दाईं ओर अच्छी तरह से सेल समाधान के पांच माइक्रोलीटर पिपेट, इसके बाद पांच माइक्रोलीटर निचले दाईं ओर अच्छी तरह से। यह जांचने के लिए माइक्रोस्कोप का उपयोग करें कि कोशिकाओं ने चैनल में प्रवेश किया है।
चिप के नीचे का पालन करने के लिए कोशिकाओं के लिए पांच मिनट इंतजार करें । पिपेट एनएससी मीडिया के लगभग 150 माइक्रोलीटर दाएं और बाएं कुओं में। एक उपयुक्त आर्द्रीकृत कंटेनर के भीतर 5% CO2, 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
48 घंटों के बाद, कुओं से एनएससी मीडिया को हटा दें और प्रत्येक शीर्ष पर अच्छी तरह से और प्रत्येक नीचे अच्छी तरह से 150 माइक्रोलीटर जोड़कर तंत्रिका भेदभाव मीडिया के साथ बदलें। संस्कृति न्यूरॉन्स एक 5% CO2 के भीतर, ३७ डिग्री सेल्सियस एक ह्यूमिडिफायर ट्रे के भीतर इनक्यूबेटर । एक्सोनल डिब्बे से शेष तंत्रिका विभेदन मीडिया को हटा दें और इसे एक अपकेंद्रित्र ट्यूब में रखें।
37 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। गर्म मीडिया के 150 माइक्रोलीटर के साथ वायरस समाधान के 50 माइक्रोलीटर मिलाएं। एक् सल के डिब्बे के दोनों कुओं में मिश्रण के पिपेट 100 माइक्रोलीटर।
37 डिग्री सेल्सियस इनक्यूबेटर के भीतर दो घंटे के लिए इनक्यूबेट। वायरस युक्त मीडिया को वापस लें और निपटाएं। धीरे-धीरे एक एक्सॉन डिब्बे को ताजा मीडिया के 75 माइक्रोलीटर अच्छी तरह से पिपेट करें और मीडिया को चैनल के माध्यम से अन्य एक्सॉन में अच्छी तरह से प्रवाहित करें।
इस प्रक्रिया को एक बार दोहराएं। अंत में, बचाया मीडिया के साथ अक्षतंतु डिब्बे भरें, और चिप को इनक्यूबेटर में स्थानांतरित करें। भेदभाव मीडिया के साथ चिप में एक सप्ताह के बाद, मानव तंत्रिका स्टेम कोशिकाओं न्यूरॉन्स में विभेदित, संलग्न और दैहिक डिब्बे के भीतर समान रूप से वितरित ।
इसकी तुलना में, पीडीएमएस उपकरणों में न्यूरॉन्स ने भेदभाव मीडिया के अतिरिक्त पांच दिनों के रूप में एकत्रित किया, जिससे सेल स्वास्थ्य से समझौता किया गया। रीचेरी फ्लोरोसेंट प्रोटीन के साथ लेबल किए गए न्यूरॉन्स और डेंड्रिटिक कताई के दृश्य से पता चला कि चिप्स के भीतर एनएससी-व्युत्पन्न न्यूरॉन्स परिपक्व सिनेप्स बनाते हैं। न्यूरॉन्स उत्तेजक सिनैप्टिक मार्कर, vGlut1 के लिए लेबल थे।
इम्यूनोस्टेटिंग परिणाम बताते हैं कि वायरल लेबल वाले न्यूरॉन्स vGlut1 के साथ सह-स्थानीयकरण कर सकते हैं, और न्यूरॉन-विशिष्ट मार्कर, बीटा-ट्यूबलिन तीन। वायरल रूप से ट्रांसड्यूसेड रीचेरी न्यूरॉन्स अनुमानों को पूर्वसंचालित चिप के भीतर स्थापित एक्सॉन-स्थानीयकृत माइक्रोएनवायरमेंट में विस्तारित करते हैं। मचेरी लेबल न्यूरॉन्स की छवियों के बीच एक तुलना से पहले और तुरंत axotomy के बाद पूरी तरह से कटे हुए अक्षतंश दिखाया ।
यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि चैनल एक्सोटॉमी प्रक्रिया का प्रदर्शन करते समय छोड़कर तरल पदार्थ से भरे रहें। COC-डिब्बाबंद चिप्स का उपयोग करना आसान है और न्यूरोनल इंजरी, सिनैप्टोजेनेसिस, सिनेप्टिक प्लास्टिसिटी और रोग के रोगविज्ञान से संबंधित कई जांचों के लिए दरवाजा खोल सकता है।
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