Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Fluorescens opsving efter Photobleaching af gul fluorescerende proteiner markeret p62 i Aggresome-lignende induceret strukturer
Chapters
Summary March 26th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi beskriver en omfattende og praktisk protokol til fluorescens opsving efter photobleaching eksperimenter med levende celler. Selv om protokollen blev brugt til at måle mobilitet af gul fluorescerende proteiner-tagged p62 i aggresome-lignende menneskeskabte strukturer, kan det anvendes til en lang række mikroskopi systemer og fluorescerende proteiner.
Transcript
Eksisterende fluorescens opsving efter photobleaching, FRAP protokoller, er enten ufuldstændige eller alt for komplekse. Protokollen præsenteres i denne video er betydelig i, at det er omfattende, praktisk og ligetil. Den største fordel ved denne FRAP-teknik er, at den giver mulighed for kvantificering af proteinmobilitet i og mellem delcellerum i levende celler.
FRAP er ved at blive undersøgt til både terapeutiske og diagnostiske formål. En sådan anvendelse er at kvantificere diffusion inden for lægemiddelleveringssystemer i forskellige væv in vivo. Disse oplysninger kan ved hjælp af bruges til at optimere et lægemiddel struktur og sammensætning.
FRAP-mikroskopiteknikken har givet indsigt på en bred vifte af områder, hvor forståelse af diffusionsfænomen er af interesse. Disse omfatter celle- og molekylærbiologi, udviklingsbiologi, neurovidenskab, materialevidenskab, avancerede biomaterialer og opdagelse af lægemidler. Selv om den beskrevne protokol er til brug med pattedyrceller, kan begreberne anvendes på andre systemer, såsom planteceller, gærceller og bakterier.
En person, der aldrig har udført denne teknik kan kæmpe med at bestemme de optimale billede erhvervelse parametre, skabe en erhvervelse region af interesse, der er egnet til deres eksperiment, og beregning af den mobile fraktion og halftime af nyttiggørelse. Når du forsøger denne procedure for første gang, skal du sørge for at udføre flere pilotforsøg for at optimere protokollen i forbindelse med formålet med dit eksperiment. Demonstration af proceduren vil være Maleen Cabe, en tekniker fra mit laboratorium, og David Rademacher, kernen imaging facilitet manager.
Til at begynde, forberede en plade af YFP-p62 transficeret RAW264.7 makrofager, og behandle dem med Lipopolysaccharid som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Skyl derefter de behandlede celler med iskold Tyrods buffer én gang. Derefter tilsættes to milliliter Nocodazol-suppleret Tyrod's buffer til pladen, og lad pladerne til at inkubere ved fire grader Celsius i 15 til 20 minutter før FRAP billeddannelse og analyse.
Lad pladerne inkubere ved fire grader Celsius i 15 til 20 minutter før FRAP-billeddannelse og analyse. Over på billeddannelse setup, skal du vælge 514 nanometer linje Argon / 2 laser, som fluorescens markør har en peak excitation på 512 nanometer, og en peak emission på 527 nanometer. Klik derefter på Argon/2, 458, 477, 488, 514 i vinduet Laserkontrol, og klik derefter på knappen Standby.
Når du har ventet ca. tre minutter på, at laseren skal varmes op, skal du klikke på knappen Til. Indstil derefter lasereffekten af laseren til 100 %, og tryk på Enter. Dernæst indstille transmission af laser linje til 5%På mikroskopet, drej til Plan-Apochromat 63x forstørrelse 1,40 numerisk blænde olie mål.
Se prøven gennem mikroskopet okular og placere en aggresome-lignende induceret struktur i midten af synsfeltet. Derefter skal du i anskaffelsessoftwaren indstille rammestørrelsen til 512 gange 512 pixel, scanningshastigheden til otte og datadybden til 12 Bit. Angiv også scanningsgennemsnittet til ét, den optiske zoom til tre, og tryk på Enter.
Dernæst se pinhole til 1,95 fejlenheder og detektor gevinst til 582, hvilket er lige under mætning. Opret et kvadratisk interesseområde for billedopekøbet, der har dimensionerne 150 gange 150 pixel. Konfigurer tidsserierne, så interesseområdet scannes 35 gange, en gang hvert 30.
Derefter indstille blegemiddel kontrol sådan, at photobleaching vil forekomme efter scanning nummer fem, for at indsamle fem prebleach billeder af regionen af interesse. Tryk på Enter for at bekræfte. Dernæst skal du gå til Vinduet Bleach Regioner og skabe en cirkulærformet blegemiddelregion af interesse inden for det aggresome-lignende inducerede strukturområde, der har en diameter på 10 pixels.
Angiv nu antallet af gentagelser til 300, og tryk igen på Enter. Derefter skal du indstille laserlinjen til 100 %strøm, og indtast 100 i feltet transmissionsprocent for laseren, og tryk på Enter. Endelig køre billedet erhvervelse program til at indsamle FRAP data fra 10 aggresome-lignende inducerede strukturer i 10 celler med mindre end omkring tre mikron af drift.
For at starte dataanalyse, først overføre AIM lsm filer til en personlig computer til dataanalyse. Korrekt for billeddrift ved at justere eller matche stakken af tidsseriebilleder af anskaffelsesområdet af interesse ved at åbne hver AIM lsm-fil med et billedbehandlingsprogram. Vælg derefter Plugins, Registrering, StackReg og Oversættelse efterfulgt af valg af plugins, registrering, StackReg og derefter Rigid Body.
Dernæst oprette regionen interesse manager til at måle signalintensiteten i blegemiddel region af interesse. Til dette skal du markere det ovale værktøj, derefter tegne en cirkel i blegemiddelområdet af interesse med en diameter på 10 pixel og derefter klikke på knappen Tilføj. Når det er tilføjet, skal du konfigurere programmet til at måle signalintensiteten i det pågældende kontrolområde.
Vælg rektangelværktøjet, tegn derefter en firkant på 20 ud af 20 pixel i kontrolområdet, og klik på knappen Tilføj. Endelig oprettes interesseforvalteren for at måle signalintensiteten i området af interesse. Vælg rektangelværktøjet, tegn en firkant på 20 ud af 20 pixel i baggrundsområdet, og klik derefter på knappen Tilføj.
Når du har tilføjet de områder, der skal analyseres i ROI Manager, skal du omdøbe dem Bleach ROI, Kontrolafkastet og baggrundsafkastet i overensstemmelse hermed. Mål signalintensiteten i hver region. For at opnå dette skal du vælge Blege investeringsafkast, kontrolaf investeringsafkast og baggrundsafkast og derefter gå til Mere og vælge Multi measure.
Indsæt resultaterne i et regneark i kolonner med navnet henholdsvis blegeafkast, kontrolafkastet og baggrundsafkastet. Start med at korrigere signalintensiteten i bleach-investeringsafkastet og kontrolafkastet ved at trække værdierne i kolonnen baggrundsafkastet fra værdierne i kolonnen med navnet Bleach ROI og kolonnen Control ROI. Mærc disse nye kolonner Korrigeret Bleach ROI og Korrigeret Kontrol ROI.
Derefter normaliseres signalet i bleach-investeringsafkastet til det baggrundskorrigerede signal i kontrolafkastet. Opdel værdierne i kolonnen Korrigeret blegemiddelafkast med værdierne i kolonnen Rettet kontrolafkast. Mærk denne nye kolonne, normaliseret korrigeret blegemiddel ROI.
Normaliser derefter signalet i kolonnen Normaliseret korrigeret blegemiddelafkast til gennemsnittet af de fem forbleach-værdier i bleach-investeringsafkastet. Divider værdierne i kolonnen normaliseret normaliseret blegemiddelafkast med gennemsnittet af de fem forblerværdier i bleach-investeringsafkastet. Mærk denne nye kolonne, Normaliseret Korrigeret Prebleach Gennemsnitlig Bleach ROI.
Endelig skal du åbne et program til billedbehandling. Kurve passer til de normaliserede og korrigerede roi-data ved at kopiere postbleach normaliserede korrigerede værdier for genforbehold og de tilsvarende tidsværdier. Indsæt dem i vinduet Kurvemontør, vælg eksponentiel gendannelse i rullemenuen Kurvemontør, og vælg Tilpas.
Vist her er en typisk video af fluorescens opsving efter photobleaching for RAW264.7 celler behandlet med LPS. Fluorescens opsving inden for aggresome-lignende induceret struktur region af interesse, er langsom. Dette eksperiment bruger photobleaching til at undersøge graden af mobilitet p62.
p62 fluorescens i den aggresome-lignende inducerede strukturer, prebleach og postbleach, er vist her. Som beskrevet i denne video kan fluorescensintensiteten spores over tid. Efter baggrundskorrektion og normalisering kan p62-fluorescens beregnes til at beskrive den mobile fraktion som 22% den immobile fraktion som 78% og beskriver pausen af opsving inden for aggresome-lignende inducerede strukturer, som 2,14 minutter.
Husk, at det er særlig vigtigt at definere erhvervelsesregionen af interesse korrekt, så den omfatter en ALIS af interesse, en kontrolregion af interesse og en baggrundsregion af interesse. Efter denne procedure kan der anvendes andre kvantitative fluorescerende mikroskopiteknikker, såsom fluorescenstab ved fotobleaching, FLIP og selektiv fotobleaching. Mens FLIP måler graden af kontinuitet og kommunikation mellem delcellulære rum, giver selektiv fotobleaching kinetisk information om aktiv og passiv transport af proteiner til organeller eller mellem proteinrige områder.
FRAP blev oprindeligt udviklet for at kvantificere den laterale bevægelse af proteiner i cellemembraner. Efterfølgende er det blevet brugt til at kvantificere protein mobilitet inden for og mellem en række subcellulære rum, som banede vejen for forskere til at besvare spørgsmål inden for en række områder, herunder celle-og molekylærbiologi, udviklingsbiologi, neurovidenskab, materialevidenskab, avancerede biomaterialer, og lægemiddelopdagelse.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
