Biology
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Fluorescentie herstel na Photobleaching van gele fluorescerende eiwit Tagged p62 in Aggresome-achtige geïnduceerde structuren
Chapters
Summary March 26th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
We beschrijven een uitgebreide en praktische protocol voor fluorescentie herstel na photobleaching experimenten met cellen levende. Hoewel het protocol werd gebruikt voor het meten van de mobiliteit van gele fluorescerende eiwit-gelabeld p62 in aggresome-achtige geïnduceerde structuren, kan het worden toegepast op een verscheidenheid van microscopie systemen en fluorescente proteïnen.
Transcript
Bestaand fluorescentieherstel na fotobleaching, FRAP-protocollen, zijn onvolledig of te complex. Het protocol gepresenteerd in deze video is belangrijk in die zin dat het is uitgebreid, praktisch en eenvoudig. Het belangrijkste voordeel van deze FRAP-techniek is dat het mogelijk maakt voor de kwantificering van eiwitmobiliteit binnen en tussen subcellulaire compartimenten in levende cellen.
FRAP wordt bestudeerd voor zowel therapeutische als diagnostische doeleinden. Een dergelijk gebruik is het kwantificeren van diffusie binnen systemen voor de levering van geneesmiddelen in verschillende weefsels in vivo. Deze informatie kan door gebruikt worden om een drugstructuur en samenstelling te optimaliseren.
De FRAP-microscopietechniek heeft inzichten opgeleverd op een breed scala aan gebieden waarop inzicht in het verspreidingsfenomeen van belang is. Deze omvatten cel- en moleculaire biologie, ontwikkelingsbiologie, neurowetenschappen, materiaalkunde, geavanceerde biomaterialen en drugsontdekking. Hoewel het beschreven protocol voor gebruik met zoogdiercellen is, kunnen de concepten worden toegepast op andere systemen, zoals plantencellen, gistcellen en bacteriën.
Een persoon die nog nooit heeft uitgevoerd deze techniek kan worstelen bij het bepalen van de optimale beeldverwerving parameters, het creëren van een acquisitie regio van belang dat geschikt is voor hun experiment, en het berekenen van de mobiele fractie en de halftime van het herstel. Wanneer u deze procedure voor de eerste keer probeert, moet u verschillende proefexperimenten uitvoeren om het protocol te optimaliseren in de context van de doelstellingen van uw experiment. Het aantonen van de procedure zal Maleen Cabe, een technicus van mijn lab, en David Rademacher, de kern imaging facility manager.
Om te beginnen, maak een plaat van YFP-p62 transfected RAW264.7 macrofagen, en behandel ze met Lipopolysaccharide zoals beschreven in de bijbehorende tekst protocol. Spoel vervolgens de behandelde cellen een keer af met de buffer van ijskoude Tyrode. Voeg vervolgens twee milliliter nocodazole-aangevuld tyrode's buffer aan de plaat, en laat de platen in te broeden op vier graden Celsius gedurende 15 tot 20 minuten voorafgaand aan FRAP beeldvorming en analyse.
Laat de platen 15 tot 20 minuten voor frap-beeldvorming en analyse bij vier graden Celsius uitbroeden. Bij de beeldvormingsopstelling selecteert u de 514 nanometer-lijn van de Argon/2-laser, omdat de fluorescentiemarkering een piekexcitatie heeft op 512 nanometer en een piekemissie op 527 nanometer. Klik vervolgens in het venster Laserbesturing op Argon/2, 458, 477, 488, 514 en klik vervolgens op de stand-byknop.
Na ongeveer drie minuten wachten op de laser op te warmen, klikt u op de knop Aan. Stel vervolgens de laserkracht van de laser in op 100% en druk op Enter. Stel vervolgens de overdracht van de laserlijn op 5%Op de microscoop, draai je naar de Plan-Apochromat 63x vergroting 1,40 numerieke diafragma olie doelstelling.
Bekijk het exemplaar door de microscoop oculair en plaats een aggresome-achtige geïnduceerde structuur in het midden van het gezichtsveld. Stel vervolgens in de acquisitiesoftware de framegrootte in op 512 bij 512 pixels, de scansnelheid op acht en de gegevensdiepte op 12 Bit. Stel ook het scangemiddelde in op één, de optische zoom op drie en druk op Enter.
Vervolgens, se het gaatje tot 1,95 fouteenheden en detector te krijgen tot 582, dat is net onder de verzadiging. Maak een vierkant gebied van belang voor de beeldverwerving, dat de afmetingen 150 bij 150 pixels heeft. Stel de tijdreeks zo in dat het interessegebied 35 keer wordt gescand, eens per 30 seconden.
Stel vervolgens de bleekwatercontrole zodanig in dat het fotobleaching na scan nummer vijf zal plaatsvinden om vijf prebleach-afbeeldingen van het gebied van belang te verzamelen. Druk op enter om dit te bevestigen. Ga vervolgens naar het venster Bleekgebied en maak een cirkelvormig bleekmiddelgebied dat van belang is binnen het aggresome-achtige geïnduceerde structuurgebied, dat een diameter van 10 pixels heeft.
Stel nu het aantal iteraties in op 300 en druk nogmaals op Enter. Stel vervolgens de laserlijn in op 100% vermogen en voer 100 in het veld transmissiepercentage voor de laser in en druk op Enter. Ten slotte voert u het programma voor het verkrijgen van afbeeldingen uit om FRAP-gegevens te verzamelen van 10 aggresome-achtige geïnduceerde structuren in 10 cellen met minder dan ongeveer drie micron drift.
Om met data-analyse te beginnen, worden de AIM-lsm-bestanden eerst overgezet naar een personal computer voor gegevensanalyse. Correct voor beelddrift door het uitlijnen of afstemmen van de stapel tijdreeksafbeeldingen van het acquisitiegebied van belang door elk AIM-lsm-bestand te openen met een beeldverwerkingsprogramma. Selecteer vervolgens Plug-ins, Registratie, StackReg en Vertaling, gevolgd door het selecteren van Plug-ins, Registratie, StackReg en vervolgens Rigid Body.
Stel vervolgens de region of interest manager in om de signaalintensiteit in het bleekmiddelgebied van belang te meten. Selecteer hiervoor het ovale gereedschap, teken vervolgens een cirkel in het bleekmiddelgebied met een diameter van 10 pixels en klik op de knop Toevoegen. Eenmaal toegevoegd, het opzetten van het programma om signaalintensiteit te meten in het controlegebied van belang.
Selecteer het rechthoeksgereedschap, teken vervolgens een vierkant van 20 bij 20 pixels in het besturingselementgebied en klik op de knop Toevoegen. Tot slot, het opzetten van de regio van belang manager om signaal intensiteit te meten in de achtergrond regio van belang. Selecteer het rechthoeksgereedschap, teken een vierkant van 20 bij 20 pixels in het achtergrondgebied en klik op de knop Toevoegen.
Nadat u de regio's hebt toegevoegd die moeten worden geanalyseerd in ROI Manager, wijzigt u deze bij de naam Bleach ROI, Control ROI en Background ROI. Meet de signaalintensiteit in elke regio. Selecteer hiervoor De ROI van Bleach, de ROI en de ROI op de achtergrond controleren en vervolgens naar Meer gaan en selecteert u Multi Measure.
Plak de resultaten op een spreadsheet in kolommen met respectievelijk het label Bleach ROI, Control ROI en Background ROI. Begin met achtergrond het corrigeren van de signaalintensiteit in de ROI van het bleken bleekmiddel en de ROI voor controle door de waarden in de kolom met het label Achtergrond-ROI af te trekken van de waarden in de kolom met het label Bleek ROI en de kolom met het label Control ROI. Label deze nieuwe kolommen Gecorrigeerdbleek ROI en Gecorrigeerde Control ROI.
Normaliseer vervolgens het signaal in de Roi van het bleekmiddel naar het achtergrondgecorrigeerde signaal in de control-ROI. Deel de waarden in de kolom met het label Gecorrigeerde rendement van het bleken door de waarden in de kolom met het label Gecorrigeerde controle-ROI. Label deze nieuwe kolom, Normalized Corrected Bleach ROI.
Normaliseer vervolgens het signaal in de kolom Genormaliseerd gecorrigeerde rendementsfaal ROI naar het gemiddelde van de vijf prebleachwaarden in de ROI van het bleekmiddel. Verdeel de waarden in de kolom met het label Genormaliseerd Gecorrigeerde Rendementsvoorwaarde door het gemiddelde van de vijf prebleachwaarden in de ROI van het bleken. Label deze nieuwe kolom, Normalized Corrected Prebleach Average Bleach ROI.
Open ten slotte een programma voor beeldverwerking. Curve passen bij de genormaliseerde en gecorrigeerde rendementsgegevens van het bleekmiddel door de genormaliseerde gecorrigeerde rendementswaarden van het bleekmiddel en de bijbehorende tijdwaarden te kopiëren. Plak ze in het venster Curve Fitter, selecteer exponentieel herstel in het vervolgkeuzemenu Curve Fitter en selecteer Fit.
Hier wordt een typische video van fluorescentieherstel getoond na het fotobleaching voor RAW264.7-cellen die met LPS zijn behandeld. Het fluorescentieherstel binnen het aggresome-achtige geïnduceerde structuurgebied van belang, is traag. Dit experiment maakt gebruik van fotobleaching om de mate van mobiliteit van p62 te onderzoeken.
p62 fluorescentie in de aggresome-achtige geïnduceerde structuren, prebleach en postbleach, wordt hier getoond. Zoals beschreven in deze video, kan de fluorescentie intensiteit worden gevolgd in de tijd. Na achtergrondcorrectie en normalisatie kan de p62-fluorescentie worden berekend om de mobiele fractie te beschrijven als 22% van de onbeweeglijke fractie als 78%en beschrijft de rust van herstel binnen de aggresome-achtige geïnduceerde structuren, als 2,14 minuten.
Vergeet niet, het is vooral belangrijk om goed te definiëren de overname regio van belang, zodat het een ALIS van belang, een controle regio van belang, en een achtergrond regio van belang omvat. Na deze procedure kunnen andere kwantitatieve fluorescerende microscopietechnieken worden toegepast, zoals fluorescentieverlies bij fotobleaching, FLIP en selectief fotobleaching. Terwijl FLIP de mate van continuïteit en communicatie tussen subcellulaire compartimenten meet, biedt selectieve fotobleaching kinetische informatie over actief en passief transport van eiwitten naar organellen of tussen eiwitrijke gebieden.
FRAP werd aanvankelijk ontwikkeld om de laterale beweging van eiwitten in celmembranen te kwantificeren. Vervolgens is het gebruikt om eiwitmobiliteit te kwantificeren binnen en tussen een verscheidenheid aan subcellulaire compartimenten, die de weg vrijmaakten voor onderzoekers om vragen te beantwoorden op verschillende gebieden, waaronder cel- en moleculaire biologie, ontwikkelingsbiologie, neurowetenschappen, materiaalkunde, geavanceerde biomaterialen en medicijnontdekking.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
