Login processing...

JoVE Journal
Biology

This content is Open Access.

JoVE Journal Biology

Fluorescens utvinning etter Photobleaching av gule fluorescerende Protein merket p62 i Aggresome-lignende indusert strukturer

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Journal (Biology)

A Laser Capture Microdissection Protocol That Yields High Quality RNA from Fresh-frozen Mouse Bones

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Journal (Biology)

Physiological Recordings and RNA Sequencing of the Gustatory Appendages of the Yellow-fever Mosquito Aedes aegypti

Click here for the English version

Fluorescens utvinning etter Photobleaching av gule fluorescerende Protein merket p62 i Aggresome-lignende indusert strukturer

Article DOI: 10.3791/59288-v

March 26th, 2019 •

David J. Rademacher¹, Maleen Cabe², Joanna C. Bakowska²

¹Core Imaging Facility and Department of Microbiology and Immunology, Loyola University Chicago, ²Department of Molecular Pharmacology and Therapeutics, Loyola University Chicago

Chapters

Summary
Automatic Translation

English (Original)
العربية (Arabic)
中文 (Chinese)
dansk (Danish)
Nederlands (Dutch)
français (French)
Deutsch (German)
עברית (Hebrew)
हिंदी (Hindi)
italiano (Italian)
日本語 (Japanese)
한국어 (Korean)
norsk (Norwegian)
português (Portugese)
русский (Russian)
español (Spanish)
svenska (Swedish)
Türkçe (Turkish)

March 26th, 2019

Please note that all translations are automatically generated.

Click here for the English version.

Vi beskriver en omfattende og praktisk protokoll for fluorescens gjenoppretting etter photobleaching eksperimenter med live celler. Selv om protokollen ble brukt til å måle mobilitet av gule fluorescerende protein-merket p62 i aggresome-lignende menneskeskapte strukturer, kan den brukes til en rekke mikroskopi systemer og fluorescerende proteiner.

Transcript

Eksisterende fluorescensgjenoppretting etter fotobleaching, FRAP-protokoller, er enten ufullstendige eller altfor komplekse. Protokollen som presenteres i denne videoen er betydelig ved at den er omfattende, praktisk og grei. Den største fordelen med denne FRAP-teknikken er at den gir mulighet for kvantifisering av proteinmobilitet i og mellom subcellulære rom i levende celler.

FRAP studeres for både terapeutiske og diagnostiske formål. En slik bruk er å kvantifisere diffusjon i legemiddelleveringssystemer i forskjellige vev in vivo. Denne informasjonen kan brukes til å optimalisere en legemiddelstruktur og sammensetning.

FRAP-mikroskopiteknikken har gitt innsikt i et bredt spekter av felt der forståelse av diffusjonsfenomen er av interesse. Disse inkluderer celle- og molekylærbiologi, utviklingsbiologi, nevrovitenskap, materialvitenskap, avanserte biomaterialer og narkotikaoppdagelse. Selv om protokollen som er beskrevet er for bruk med pattedyrceller, kan begrepene brukes på andre systemer, for eksempel planteceller, gjærceller og bakterier.

En person som aldri har utført denne teknikken, kan slite med å bestemme de optimale bildeanskaffelsesparametrene, skape et oppkjøpsområde av interesse som er egnet for eksperimentet, og beregne mobilfraksjon og pause for utvinning. Når du prøver denne prosedyren for første gang, må du utføre flere piloteksperimenter for å optimalisere protokollen i sammenheng med målene for eksperimentet. Å demonstrere prosedyren vil være Maleen Cabe, en tekniker fra laboratoriet mitt, og David Rademacher, sjefen for avbildningsanlegget.

Til å begynne med, klargjør en plate med YFP-p62 transfected RAW264.7 makrofager, og behandle dem med Lipopolysakkarid som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Skyll deretter de behandlede cellene med iskald Tyrodes buffer en gang. Deretter legger du til to milliliter nocodazol-supplert Tyrodes buffer til platen, og la platene inkubere ved fire grader Celsius i 15 til 20 minutter før FRAP-avbildning og analyse.

La platene inkubere ved fire grader Celsius i 15 til 20 minutter før FRAP-bildebehandling og analyse. Over på bildeoppsettet, velg 514 nanometer linjen av Argon /2 laser, som fluorescens markør har en topp eksitasjon på 512 nanometer, og en topp utslipp på 527 nanometer. Deretter klikker du Argon/2, 458, 477, 488, 514, i laserkontrollvinduet, og deretter klikker du på Standby-knappen.

Når du har ventet omtrent tre minutter på at laseren skal varmes opp, klikker du på På-knappen. Sett deretter laserkraften til laseren til 100%, og trykk Enter. Deretter setter du overføringen av laserlinjen til 5%På mikroskopet, slå til Plan-Apochromat 63x forstørrelse 1,40 numerisk blenderåpning olje mål.

Se prøven gjennom mikroskopets okular og plasser en aggresom-lignende indusert struktur i midten av synsfeltet. Deretter, i anskaffelsesprogramvaren, setter du bildestørrelsen til 512 med 512 piksler, skannehastigheten til åtte og datadybden til 12 Bit. Sett også skannegjennomsnittet til ett, den optiske zoomen til tre, og trykk Enter.

Deretter se pinhole til 1,95 feilenheter og detektor gevinst til 582, som er like under metning. Opprett et firkantet område av interesse for bildeanskaffelsen, som har dimensjonene 150 og 150 piksler. Konfigurer tidsserien slik at interesseområdet skannes 35 ganger, én gang hvert 30.

Deretter angir du blekemiddelkontrollen slik at fotobleaching vil skje etter skanning nummer fem, for å samle fem prebleach bilder av interesseområdet. Trykk enter-tasten for å bekrefte. Deretter går du til Bleach Regions-vinduet og oppretter et sirkulært blekemiddelområde av interesse innenfor det aggresomlignende induserte strukturområdet, som har en diameter på 10 piksler.

Nå angir du antall iterasjoner til 300, og trykk igjen enter-tasten. Deretter setter du laserlinjen til 100 % strøm, og skriver inn 100 i feltet for overføringsprosent for laseren, og trykker Enter. Til slutt kjører du bildeanskaffelsesprogrammet for å samle frap-data fra 10 aggresome-lignende induserte strukturer i 10 celler med mindre enn tre mikrometer drift.

For å starte dataanalyse, først overføre AIM lsm filer til en personlig datamaskin for dataanalyse. Riktig for bildedrift ved å justere eller matche bunken med tidsseriebilder av oppkjøpsområdet av interesse ved å åpne hver AIM lsm-fil med et bildebehandlingsprogram. Deretter velger du Plugins, Registrering, StackReg og Oversettelse, etterfulgt av å velge Plugins, Registrering, StackReg og deretter Rigid Body.

Deretter setter du opp interesselederen for å måle signalintensiteten i blekemiddelområdet av interesse. For dette velger du det ovale verktøyet, tegn deretter en sirkel i blekemiddelområdet av interesse med en diameter på 10 piksler, og klikk deretter Legg til-knappen. Når det er lagt til, konfigurerer du programmet for å måle signalintensiteten i kontrollområdet av interesse.

Merk rektangelverktøyet, tegn deretter en firkant på 20 og 20 piksler i kontrollområdet, og klikk Legg til-knappen. Til slutt setter du opp interesselederen for å måle signalintensiteten i bakgrunnsområdet av interesse. Velg rektangelverktøyet, tegn en firkant på 20 og 20 piksler i bakgrunnsområdet, og klikk deretter Legg til-knappen.

Når du har lagt til områdene som skal analyseres i ROI Manager, gi dem endre navn på Bleach ROI, Control ROI og Background ROI, tilsvarende. Mål signalintensiteten i hvert område. Hvis du vil oppnå dette, velger du Blekemiddelavkastning, Kontrollavkastning og Bakgrunnsavkastning, og deretter går du til Mer og velger Flere mål.

Lim inn resultatene i et regneark i kolonner merket henholdsvis Bleach ROI, Control ROI og Background ROI. Start med bakgrunn som korrigerer signalintensiteten i Bleach ROI og Kontrollavkastningen ved å trekke verdiene i kolonnen merket Bakgrunnsavkastning fra verdiene i kolonnen merket Bleach ROI, og kolonnen merket Control ROI. Merk disse nye kolonnene Korrigert Bleach ROI og Korrigert kontrollavkastning.

Deretter normaliserer du signalet i Bleach ROI til det bakgrunnskorrigerte signalet i kontrollavkastningen. Del verdiene i kolonnen merket Korrigert bleach roi med verdiene i kolonnen merket Korrigert kontroll roi. Merk denne nye kolonnen, Normalisert korrigert bleach roi.

Deretter normaliserer du signalet i kolonnen Normalisert korrigert bleach roi til gjennomsnittet av de fem prebleach-verdiene i Bleach ROI. Del verdiene i kolonnen merket Normalisert Korrigert Bleach ROI med gjennomsnittet av de fem prebleach-verdiene i Bleach ROI. Merk denne nye kolonnen, Normalisert korrigert prebleach gjennomsnittlig blekemiddelavkastning.

Til slutt åpner du et program for bildebehandling. Curve passer til de normaliserte og korrigerte blekemiddelavkastningsdataene ved å kopiere postbleach normaliserte korrigerte blekemiddelavkastningsverdier og tilsvarende tidsverdier. Lim dem inn i kurvemontørvinduet, velg eksponentiell gjenoppretting fra rullegardinmenyen Kurvemontør, og velg Tilpass.

Vist her er en typisk video av fluorescens utvinning etter photobleaching for RAW264.7 celler behandlet med LPS. Fluorescensutvinningen innenfor den aggresome-lignende induserte strukturområdet av interesse, er treg. Dette eksperimentet bruker fotobleaching for å undersøke graden av mobilitet av p62.

p62 fluorescens i aggresome-lignende induserte strukturer, prebleach og postbleach, er vist her. Som beskrevet i denne videoen, kan fluorescensintensiteten spores over tid. Etter bakgrunnskorrigering og normalisering kan p62 fluorescens beregnes for å beskrive den mobile fraksjonen som 22% immobil brøkdelen som 78%, og beskriver pausen av utvinning innenfor de aggresomlignende induserte strukturer, som 2,14 minutter.

Husk at det er spesielt viktig å definere oppkjøpsområdet av interesse på riktig måte, slik at det inkluderer en ALIS av interesse, et kontrollområde av interesse og en bakgrunnsregion av interesse. Etter denne prosedyren kan andre kvantitative fluorescerende mikroskopiteknikker brukes, for eksempel fluorescenstap i fotobleaching, FLIP og selektiv fotobleking. Mens FLIP måler graden av kontinuitet og kommunikasjon mellom subcellulære rom, gir selektiv fotobleking kinetisk informasjon om aktiv og passiv transport av proteiner til organeller, eller mellom proteinrike områder.

FRAP ble opprinnelig utviklet for å kvantifisere den laterale bevegelsen av proteiner i cellemembraner. Deretter har det blitt brukt til å kvantifisere proteinmobilitet innenfor og mellom en rekke subcellulære rom, som banet vei for forskere å svare på spørsmål på en rekke felt, inkludert celle- og molekylærbiologi, utviklingsbiologi, nevrovitenskap, materialvitenskap, avanserte biomaterialer og narkotikaoppdagelse.

X

Simple Hit Counter