Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Hurtig Lipid Droplet Isolation protokollen ved hjælp af en almindelig Organelle isolering Kit
Chapters
Summary
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Denne protokol fastsætter en roman metode af lipid droplet isolering og oprensning fra mus lever, ved hjælp af en veletableret endoplasmatiske reticulum isolering kit.
Transcript
Forskning i lipid dråbe biologi er blevet hæmmet af vanskeligheder med rensning. Derudover, studere cellulære lipid flux kræver samtidig rensning af flere organeller, og ingen enkle protokoller var i øjeblikket tilgængelige. Den største fordel ved denne teknik er at gøre lipid dråberensning mere tilgængelig.
Vi har ændret et kommercielt tilgængeligt sæt til samtidig at isolere lipiddråber, endoplasmatisk reticulum og lysosomer fra en enkelt prøve. Lever lipid dråbe ophobning prædisponerer overvægtige og alkoholiske patienter til progressiv leversygdom. Dette har flyttet visningen af lipiddråber fra inerte opbevaringsrum til dynamiske biologisk vigtige organeller.
Til at begynde, bruge sterile kraftbefængte og dissektion saks til at skære hud og muskler lag af maven af den aflivede mus på den bageste-forreste akse, udsætter leveren. Skær ledbånd forbinder leveren til tarmen. Ved hjælp af spån, trække tarmen væk fra leveren, mod den bageste.
Skær ledbånd forbinder leveren til mellemgulvet. Derefter skæres mellem leveren og den dorsale brystkasse, bevæger sig fra forreste til bageste, indtil leveren er befriet. Overfør leveren til en kold fem-centimeter petriskål med 10 milliliter koldt 1x PBS, og vask leveren to gange på en gyngeplatform i 10 milliliter kold 1x PBS i fem minutter ved fire grader Celsius.
Efter den endelige vask, hæld 1x PBS, og bruge en størrelse-10 steril kirurgisk klinge til at terninger leveren i tre-til fem-millimeter stykker i skålen. Derefter vaskes hakkede lever to gange med 10 milliliter kold 1x PBS i fem minutter ved fire grader Celsius. Dekanter 1x PBS, og overføre hakkede leverstykker til en kold 45-milliliter Dounce homogenisator, sikre alle stykker er i bunden.
Tilføj syv milliliter kold 1x IE buffer. Homogeniser på is ved at flytte støderen op og ned 20 gange, og sørg for, at støderen går til bunden af homogenisen under hvert slag. Homogenatet overføres til et koldt 15-milliliter centrifugerør.
Homogenisatoren skylles med en milliliter kold 1x IE-buffer, og tilsæt den til resten af homogenatet. For at fjerne kerner centrifuge homogenatet i en centrifuge med høj kapacitet ved 1,000 gange g i 10 minutter ved fire grader Celsius. Sørg for, at lipider, der er samlet øverst på 15-milliliterrøret, resuspendeses for at forhindre tab af LD.
Sørg for, at nuklear pellet i bunden af røret er uforstyrret, overføre lipid-holdige post-nukleare supernatant til en frisk kold 50-milliliter centrifuge rør. Overfør en 100-mikroliter aliquot af post-nukleare supernatant til en kold 1,7-milliliter mikrocentrifuge rør på is til senere renhed analyse. For at fjerne mitokondrier, centrifuge den post-nukleare supernatant prøve i en nedkølet højhastighedscentrifuge på 12, 000 gange g i 15 minutter ved fire grader Celsius.
Sørg for, at lipider, der er samlet i toppen af røret, opslænnes for at forhindre tab af LD, og overfør derefter det post-mitokondrielle supernatant til et 13-milliliter ultracentrifugerør. Overfør en 100-mikroliter aliquot af post-mitokondriel supernatant til en kold 1,7-milliliter mikrocentrifuge rør på is til senere renhed analyse. Fyld ultracentrifuge røret med post-mitokondriel supernatant til randen med kold 1x IE buffer, for at forhindre det kollapser under ultracentrifugering.
Balance prøverne, og derefter centrifuge i en ultracentrifuge ved 100, 000 gange g i 60 minutter ved fire grader Celsius. For at fjerne LD-laget skal du vippe røret i en vinkel på 45 grader og aspirere med en glaspipette. Efter overførsel af pellet til en kold 1,7-milliliter mikrocentrifuge rør, indsamle 100 mikroliter af post-ER supernatant under lipid lag for renhed analyse.
At pellet enhver celle vragrester, centrifuge i en mikrocentrifuge ved tophastighed i fem minutter ved fire grader Celsius. Derefter varme røret forsigtigt med hænder til at hjælpe resuspendere LD lag, og overføre supernatant, herunder lipid lag, til en ny 1,7-milliliter mikrocentrifuge rør. Gentag disse vasketrin, opvarmning røret to til tre gange, indtil pellet ikke længere er synlig.
Derefter, at vaske pellet-fri LD supernatant, tilføje 1x PBS til et endeligt volumen på 1,5 milliliter, og centrifuge i en mikrocentrifuge ved tophastighed i fem minutter ved fire grader Celsius. Brug en glaspipette til at fjerne en milliliter 1x PBS, som er under lipidlaget, uden at forstyrre lipidlaget. Gentag LD vask fire til fem gange, indtil 1x PBS er visuelt gennemsigtig uden turbiditet.
Brug derefter en glaspipette til at fjerne alle 1x PBS under lipidlaget, og brug den resulterende rene LD-fraktion til downstream-analyse. Når repræsentative 20x fluorescerende og brightfield LD billeder blev taget fra både ER kit LD isolation og saccharose LD isolation metoder, de afslørede lignende niveauer af partikler, hvilket tyder på lignende renhed ved hjælp af to forskellige protokoller. Efter rensningen blev LD-triglycerid- og proteinniveauerne målt ved hjælp af kolometriske analyser, og dataene blev normaliseret til levervægt, hvilket viste, at når udgangsmaterialet blev normaliseret, var LD triglycerid og proteinudbytte ens ved hjælp af ER-sættet og saccharosemetoden.
LD diametre blev kvantificeret ved hjælp af billedanalyse software, der viser, at ER kit LD isolation og saccharose LD isolation gav LDs af samme størrelse. For at vurdere LD renhed, prøver blev analyseret ved immunoblotting, viser, at DE stammer fra ER kit LD isolation og saccharose gradient protokol begge havde samme renhed. PLIN2, en LD-markør, blev påvist i alle prøver undtagen ER-sættet LD isolation PER og saccharose's PNS.
Renhedsanalyse af en ER-fraktion ved hjælp af immunoblots viser, at de var fri for LD-markør PLIN2, men havde betydelige niveauer af ER SEC61A-proteinet. Renheden af en lysosomal fraktion efter yderligere rensning af lysosomer ved hjælp af lysosomberigelsessættet blev også vurderet. Discovery er i øjeblikket den mest nyttige anvendelse af vores protokol.
Vi udfører lipidomics i rensede organeller, og viste lipotoxiner er steget specifikt i lipid dråber i alkoholisk leversygdom.
Tags
Biologi spørgsmålet 146 Lipid droplet isolation lever perilipin 2 endoplasmatiske reticulum saccharose gradient isotonisk ekstraktionsbufferRelated Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
