एक अच्छी तरह से स्थापित Organelle अलगाव किट का उपयोग रैपिड लिपिड छोटी बूंद आइसोलेशन प्रोटोकॉल

लिपिड बूंद जीव विज्ञान में अनुसंधान शुद्धि की कठिनाई से बाधित किया गया है । इसके अतिरिक्त, सेलुलर लिपिड प्रवाह का अध्ययन करने के लिए कई ऑर्गेनेल्स के एक साथ शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है, और वर्तमान में कोई सरल प्रोटोकॉल उपलब्ध नहीं था। इस तकनीक का मुख्य लाभ लिपिड बूंद शुद्धिकरण को अधिक सुलभ बनाना है।

हमने एक व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट को एक साथ लिपिड बूंदों, एंडोप्लाज्मिक रेटिकुलम और लाइसोसोम्स को एक ही नमूने से अलग करने के लिए संशोधित किया। जिगर लिपिड बूंद संचय प्रगतिशील जिगर की बीमारी के लिए मोटापे से ग्रस्त और शराबी रोगियों predisposes । इससे निष्क्रिय भंडारण डिब्बों से लिपिड बूंदों के दृश्य को गतिशील जैविक रूप से महत्वपूर्ण ऑर्गेनेल्स में स्थानांतरित कर दिया गया है ।

शुरू करने के लिए, पीछे के पूर्वकाल धुरी पर इच्छामृत्यु माउस के पेट की त्वचा और मांसपेशियों की परतों को काटने के लिए बाँझ संदंश और विच्छेदन कैंची का उपयोग करें, जिगर को उजागर करें। लिवर को आंत से जोड़ने वाले लिगामेंट्स को काट लें। संदंश का उपयोग करना, आंत को जिगर से दूर खींचें, पीछे की ओर।

लिवर को डायाफ्राम से जोड़ने वाले स्नायु को काट लें। फिर, जिगर और पृष्ठीय रिबकेज के बीच काटें, पूर्वकाल से पीछे की ओर बढ़ते हैं, जब तक कि यकृत मुक्त न हो जाए। जिगर को ठंडे 1x PBS के 10 मिलीलीटर के साथ एक ठंडे पांच सेंटीमीटर पेट्री डिश में स्थानांतरित करें, और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ठंड 1x PBS के 10 मिलीलीटर में एक कमाल के मंच पर दो बार जिगर को धोएं ।

अंतिम धोने के बाद, 1x PBS बंद डालो, और एक आकार-10 बाँझ शल्य ब्लेड का उपयोग करने के लिए पकवान के भीतर तीन से पांच मिलीमीटर टुकड़े में जिगर पासा । फिर, चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए ठंड 1x PBS के 10 मिलीलीटर के साथ दो बार कटा हुआ जिगर धोएं । 1x PBS decant, और एक ठंडा ४५-मिलीलीटर Dounce समरूपता के लिए diced जिगर के टुकड़े हस्तांतरण, सभी टुकड़ों को सुनिश्चित करने के नीचे हैं ।

कोल्ड 1x आईई बफर के सात मिलीलीटर जोड़ें। मूसल को 20 बार ऊपर और नीचे ले जाकर बर्फ पर समरूपता, यह सुनिश्चित करना कि मूसल प्रत्येक स्ट्रोक के दौरान समरूप के नीचे चला जाता है। समरूप को ठंडे 15 मिलीलीटर सेंट्रलाइज ट्यूब में स्थानांतरित करें।

कोल्ड 1x आईई बफर के एक मिलीलीटर के साथ समरूप कुल्ला, और यह समरूप के बाकी हिस्सों में जोड़ें । नाभिक को हटाने के लिए, चार डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1, 000 बार जी पर उच्च क्षमता वाले अपकेंद्रित्र में समरूप को अपकेंद्रित्र करें। सुनिश्चित करें कि 15 मिलीलीटर ट्यूब के शीर्ष पर इकट्ठे हुए किसी भी लिपिड को एलडी नुकसान को रोकने के लिए फिर से निलंबित कर दिया गया है।

यह सुनिश्चित करना कि ट्यूब के तल पर परमाणु गोली अव्यवस्थित है, लिपिड युक्त पोस्ट-न्यूक्लियर सुपरनेट को एक ताजा ठंडी 50-मिलीलीटर अपकेंद्रित्र ट्यूब में स्थानांतरित करें। बाद में शुद्धता विश्लेषण के लिए बर्फ पर एक ठंडा १.७-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के लिए परमाणु सुपरनेट के बाद के एक १००-माइक्रोलीटर aliquot स्थानांतरित करें । माइटोकॉन्ड्रिया को हटाने के लिए, चार डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए 12, 000 बार जी पर एक रेफ्रिजरेटेड हाई-स्पीड सेंट्रलाइज में परमाणु सुपरनेट के बाद के नमूने को अपकेंद्रित्र करें ।

सुनिश्चित करें कि ट्यूब के शीर्ष पर इकट्ठे हुए किसी भी लिपिड को एलडी नुकसान को रोकने के लिए फिर से निलंबित कर दिया गया है, और फिर पोस्ट-माइटोकॉन्ड्रियल सुपरनेट को 13-मिलीलीटर अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। बाद में शुद्धता विश्लेषण के लिए बर्फ पर एक ठंडी 1.7 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब के बाद माइटोकॉन्ड्रियल सुपरनेट के 100-माइक्रोलीटर एलिकोट को स्थानांतरित करें। अल्ट्रासेंट्रफ्यूज के दौरान गिरने से रोकने के लिए, ठंडे 1x आईई बफर के साथ किनारा करने के लिए पोस्ट-माइटोकॉन्ड्रियल सुपरनेट के साथ अल्ट्रासेंट्रफ्यूज ट्यूब भरें।

नमूनों को संतुलित करें, और फिर चार डिग्री सेल्सियस पर ६० मिनट के लिए १००, 000 बार जी पर एक अल्ट्रासेंट्रफ्यूज में अपकेंद्रित्र । एलडी लेयर को हटाने के लिए, ट्यूब को 45 डिग्री कोण पर झुकाएं, और ग्लास पिपेट के साथ एस्पिरेट करें। गोली को ठंडे 1.7-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करने के बाद, शुद्धता विश्लेषण के लिए लिपिड परत के तहत पोस्ट-ईआर सुपरनेट के 100 माइक्रोलीटर एकत्र करें।

किसी भी सेल मलबे को गोली मारने के लिए, चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए शीर्ष गति से एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में अपकेंद्रित्र । फिर, एलडी परत को फिर से खर्च करने में मदद करने के लिए हाथों से ट्यूब को धीरे-धीरे गर्म करें, और लिपिड परत सहित सुपरनेट को एक नए 1.7-मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें। इन धोने के चरणों को दोहराएं, ट्यूब को दो से तीन बार गर्म करें, जब तक कि गोली दिखाई न दे।

फिर, पैलेट-फ्री एलडी सुपरनेट को धोने के लिए, 1x पीबीएस को 1.5 मिलीलीटर की अंतिम मात्रा में जोड़ें, और चार डिग्री सेल्सियस पर पांच मिनट के लिए शीर्ष गति पर एक माइक्रोसेंट्रफ्यूज में सेंट्रलाइज करें। लिपिड परत को परेशान किए बिना, लिपिड परत के नीचे है, जो 1x PBS के एक मिलीलीटर को हटाने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें। एलडी धोने को चार से पांच बार दोहराएं, जब तक कि 1x पीबीएस नेत्रहीन रूप से पारदर्शी न हो।

फिर, लिपिड परत के नीचे सभी 1x पीबीएस को हटाने के लिए एक ग्लास पिपेट का उपयोग करें, और डाउनस्ट्रीम विश्लेषण के लिए परिणामी शुद्ध एलडी अंश का उपयोग करें। जब प्रतिनिधि 20x फ्लोरोसेंट और ब्राइटफील्ड एलडी छवियों दोनों ईआर किट एलडी अलगाव और सुक्रोज एलडी अलगाव तरीकों से लिया गया था, वे कण पदार्थ के समान स्तर से पता चला, दो अलग प्रोटोकॉल का उपयोग कर इसी तरह की शुद्धता का सुझाव । शुद्धिकरण के बाद, एलडी ट्राइग्लिसराइड और प्रोटीन के स्तर को कोलोरिमेट्रिक परख का उपयोग करके मापा गया था, और डेटा को यकृत वजन में सामान्यीकृत किया गया था, यह दिखा रहा है कि जब शुरुआती सामग्री को सामान्यीकृत किया गया था, तो एलडी ट्राइग्लिसराइड और प्रोटीन पैदावार ईआर किट और सुक्रोज विधि का उपयोग करके समान थे।

एलडी व्यास छवि विश्लेषण सॉफ्टवेयर का उपयोग करके मात्रा निर्धारित किए गए थे, जिसमें यह दर्शाया गया था कि ईआर किट एलडी अलगाव और सुक्रोज एलडी अलगाव ने समान आकारों की एलडी प्राप्त की है। एलडी शुद्धता का आकलन करने के लिए, नमूनों को इम्यूनोब्लोटिंग द्वारा आसक्त किया गया था, जिसमें यह दर्शाया गया था कि ईआर किट एलडी अलगाव और सुक्रोज रेडिएंट प्रोटोकॉल दोनों से प्राप्त एलडी में समान शुद्धता थी। PLIN2, एक एलडी मार्कर, ईआर किट एलडी अलगाव प्रति और सुक्रोज के पीएनएस को छोड़कर सभी नमूनों में पाया गया था ।

इम्यूनोब्लॉट का उपयोग करके एक ईआर अंश की शुद्धता विश्लेषण से पता चलता है कि वे एलडी मार्कर PLIN2 से मुक्त थे, लेकिन ईआर SEC61A प्रोटीन का महत्वपूर्ण स्तर था। लाइसोसोम एनरिचमेंट किट का उपयोग करके लाइसोसोम्स की आगे शुद्धि के बाद एक लाइसोसोमल अंश की शुद्धता का भी आकलन किया गया। डिस्कवरी वर्तमान में हमारे प्रोटोकॉल का सबसे उपयोगी आवेदन है।

हम शुद्ध ऑर्गेनेल्स में लिपिडोमिक्स करते हैं, और दिखाया गया कि लिपिोटॉक्सिन विशेष रूप से मादक जिगर की बीमारी में लिपिड बूंदों में बढ़ जाते हैं।