Developmental Biology
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코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포
Chapters
Summary April 18th, 2019
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우리는 이러한 keratinocytes 및 섬유 아 세포를 사용 하 여 유도 만능 줄기 세포 유래 keratinocytes 및 섬유 아 세포 분화 및 3D 피부 organoid, 생성 하는 방법을 보여 주는 프로토콜을 제안 합니다. 이 프로토콜 humanized 마우스 모델을 생성 하는 추가 단계를 포함 합니다. 여기에 제시 된 기술 피부과 연구를 향상 됩니다.
Transcript
코드 혈액 단핵 세포, 또는 CBMC는 인간 백혈구 항원 타이핑이 세포 뱅킹 시스템에 필수적이기 때문에 재생 의학을 위한 잠재적인 세포 근원으로 부상했습니다. CBMC 유도 만능 줄기 세포, 또는 CMBC-iPSCs는 각질 세포 및 섬유아세포로 분화될 수 있다. 3D 피부 오르간노이드를 생성하기 위해 피부과 연구를 사용하고 있습니다.
CBMC-iPSC를 비트론틴 코팅 100밀리리터 플레이트에 섭씨 37도, 이산화탄소 10%로 배양하는 것으로 시작합니다. 세포가 80%에 도달하면 PBS로 배양을 세척하고 접시당 1밀리리터 EDTA1밀리리터로 섭씨 37도, 이산화탄소 5%로 2분간 치료합니다. 세포가 분리되면 플레이트 당 E8 배지의 3 밀리리터로 반응을 멈추고 원심분리에 의해 세포를 수집합니다.
계산을 위해 E8 배지의 5밀리리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 원심분리를 위해 1회-10-6번째 세포를 15밀리리터 원뿔관으로 이송한다. 배아 체 형성 배지의 2.5 밀리리터로 이송된 세포를 다시 중단하고, 10-micromolar rho 관련 키나아제 또는 ROCK 억제제로 보충한다. 파이펫을 사용하여 125 마이크로리터 의 셀 방울을 코팅되지 않은 배양 판 뚜껑에 전달합니다.
모든 물방울이 배치되면 접시를 뒤집어 물방울이 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 동안 뚜껑에서 멈출 수 있도록 합니다. 다음 날, 신선한 E8 배지로 뚜껑을 세척하고 배아 체액을 50 밀리리터 원추형 튜브로 옮겨냅니다. 배아 체는 상온에서 1 분 동안 정착할 수 있도록 허용하고, 상체를 심고 그들의 분화까지 90mm 페트리 접시에 그들의 문화에 대한 신선한 E8 매체로 배아 몸을 다시 중단합니다.
CBMC-iPSC 각질 세포 분화의 경우, 배아 신체 배양에서 E8 배지를 신선한 E8 배지로 대체하고, 뼈 형태 유전학 단백질 4의 밀리리터당 1나노그램으로 보충되어 섭씨 37도, 이산화탄소 5%에서 24시간 배양에 대한다. 다음 날, 배아 시체를 시연된 대로 50밀리리터 원뿔관으로 수확하고 실온에서 1분 동안 정착할 수 있도록 합니다. 다음으로, 상체를 각질 세포 분화 배지 1 또는 KDM1의 6밀리리터로 대체하고, 10마이크로몰러 ROCK 억제제로 보충하고 배아 체를 타입 IV 콜라겐 코팅 100mm 접시로 옮킨다.
배양의 8일을 통해, 3 마이크로몰라 레티노산과 골 형태 유전학 단백질 4 및 표피 성장 인자의 각각 밀리리터 당 25 나노그램으로 보충된 신선한 KDM1로 매일 마다 배지를 대체하십시오. 9일부터 12일까지, 매일 배지를 KDM2로 대체하여, 3마이크로몰라 망막산, 뼈 형태유전학 단백질 4의 밀리리터당 25나노그램, 표피 성장 인자의 밀리리터당 20나노그램으로 보충한다. 일 13에서 30 일 사이, KDM3에 매일 배지를 변경, 뼈 형태 유전학 단백질의 밀리리터 당 10 나노 그램으로 보충 4, 표피 성장 인자의 밀리리터 당 20 나노 그램.
CBMC-iPSC 섬유아세포 분화를 위해, 10마이크로몰라 ROCK 억제제로 보충된 섬유아세포 분화 배지 1의 6밀리리터에서 배아 체배 양을 다시 중단하고, 배아 체현탁을 지하 막 매트릭스 코팅 100mm 접시로 옮킨다. 3일간의 배양 후, 배지를 섬유아세포 분화 배지 2로 변경하기 전에 4일 동안 0.5 나노몰라 뼈 형태유전학 단백질 4로 배양을 치료한다. 문화7일째에는 1주일 동안 격일로 FDM2로 변경합니다.
문화의 14일째에, 입증된 바와 같이 1밀리알러 EDTA로 세포를 분리하고, 원심분리를 위해 섬유아세포 분화 배지 2의 3밀리리터로 세포를 수집한다. 카피아세포 분화 배지 1의 5밀리리터에서 세포를 다시 중단하고, 2회-10-6번째 세포를 비코팅 된 접시로 옮기다. 문화의 21일째에, 배양에서 10-6세포를 신선한 섬유아세포 분화 배지 1에서 100mm 식으로 이송한다.
문화의 28일째에, iPSC 유래 섬유아세포의 2회-10-6을 새로운 비코팅 요리로 옮기. 3차원 피부 오르가노이드 생성을 위해, 배양에서 iPSC 유래 섬유아세포를 수확하고, 원심분리를 위해 2회-10-5번째 세포를 15밀리리터 원추형 튜브로 이송한다. 섬유아세포 분화 배지 1의 1.5 밀리리터및 중화형 I 콜라겐 용액의 1.5 밀리리터에서 섬유아세포 펠릿을 다시 중단한다.
실온에서 30분 동안 6웰 마이크로 플레이트에 삽입된 셀을 배양합니다. 용액이 고형화되면 인서드 상단에 2밀리리터의 매체를 추가하고 웰 하단에 3밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 섬유아세포 매트릭스를 겔화가 완료될 때까지 5~7일 동안 인큐베이터에 넣고 매트릭스는 더 이상 수축하지 않습니다.
인큐베이션의 끝에서, iPSC 유래 각질 세포를 수확하고, 원심분리를 위해 15 밀리리터 원추형 튜브로 1회-10-6세포를 이송한다. 낮은 칼슘 상피 배지 1의 50- 100 마이크로리터에서 펠릿을 다시 중단하고, 섬유아세포 매트릭스를 통해 매질을 각질 세포 용액으로 대체한다. 섭씨 37도에서 15분 후, 인서트 상단의 배지를 상피 매체 1의 2밀리리터로 교체하고, 하단의 배지를 동일한 3밀리리터로 잘 교체하고 플레이트를 인큐베이터로 되돌리보도록 한다.
이틀 후, 배지를 인서트와 잘 정상 칼슘 상피 배지 2로 2일 간 추가로 배양한다. 문화의 4 일째에, 모든 매체를 제거하고, 공기 액체 인터페이스를 생성하기 위해, 잘 바닥에 옥수수 화 매체의 3 밀리리터를 추가합니다. 그런 다음 다운스트림 분석을 위해 3D 스킨 오가노이드를 수확하기 전에 최대 14일 동안 플레이트를 인큐베이터에 반품합니다.
CBMC-iPSC 유래 각질 세포는 1차 각질 세포와 유사한 형태를 가지며, 이러한 세포에서 각질 세포 마커의 발현이 증가한다. CBMC-iPSC 유래 섬유아세포는 1차 섬유아세포와 유사한 형태를 가지며, 만능 줄기 세포 마커 10-4의 발현은 하향 조절되고 섬유아세포 마커는 최대 조절된다. 3D 피부 오르가노이드의 두께는 3D 배양 중에 증가하며, 3D 피부 오르가노이드가 iPSC 유래 각질 세포및 섬유아세포로부터 생성되는 것을 확인합니다.
2 주 후, 이식 된 3D 피부 오르가노이드 이식은 HNE 분석에 의해 확인된 바와 같이 수신자 마우스 피부에 효율적으로 통합됩니다. 또한, 각질세포 성숙및 표피 분화 마커는 CBMC-iPSC 유래 3D 피부 오르가노이드로 표현되어 마우스 피부 결함의 기능적 분화, 효율적인 이식 및 효과적인 치유를 입증한다. 우리는 피부 근처를 모방하기 위해 3D 피부 오르가노이드의 계층화 층을 유도 높은 칼슘 배지와 과거에 사용합니다.
분석은 피부가 계층화된다는 것을 보여줍니다. CBMC-iPSC는 피부 이식에 대한 잠재적인 세포 공급원이며, CBMC-iPSC 유래 3D 피부 오르가노이드는 피부과, 화장품 스크리닝 및 재생 의학과 관련된 연구에서 사용될 수 있다.
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