Developmental Biology
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Geração de organoides pele 3D do cordão hemoderivados induzida por células-tronco pluripotentes
Chapters
Summary April 18th, 2019
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Propomos um protocolo que mostra como diferenciar pluripotentes induzidas células-tronco derivadas de queratinócitos e fibroblastos e gerar uma pele 3D organoides, usando estes queratinócitos e fibroblastos. Este protocolo contém uma etapa adicional de gerar um modelo de ratos humanizados. A técnica aqui apresentada vai melhorar pesquisa dermatológica.
Transcript
As células mononucleares do sangue do cordão umbilical, ou CBMC, emergiram como uma fonte celular potencial para a medicina regenerativa, porque a digitação de antígeno leucócito humano é essencial para o sistema bancário celular. Células-tronco pluripotentes induzidas pelo CBMC, ou CMBC-iPSCs, podem ser diferenciadas em queratinócitos e fibroblastos. Para gerar organoide de pele 3D, estamos usando pesquisa dermatológica.
Comece por culminar cbmc-iPSC em placas de 100 mililitros revestidas de vitronectina a 37 graus Celsius e 10% de dióxido de carbono. Quando as células atingirem 80% de confluência, lave as culturas com PBS e trate-as com um mililitro de EDTA de um mililitro por placa por dois minutos a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Quando as células se separarem, pare a reação com três mililitros de E8 médio por placa, e colete as células por centrifugação.
Suspenda as pelotas em cinco mililitros de meio E8 para contagem, e transfira uma das células de 10 para o sexto para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Suspenda as células transferidas com 2,5 mililitros de meio de formação corporal embrionária, suplementadas com quinase associada a 10 micromolar, ou inibidor de ROCHA. Use uma pipeta para transferir gotículas de 125 microliter de células para uma tampa de placa de cultura não revestida.
Quando todas as gotículas tiverem sido colocadas, vire o prato para permitir que as gotículas fiquem penduradas na tampa por 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, lave a tampa com meio E8 fresco e transfira a solução do corpo embrionário para um tubo cônico de 50 mililitros. Permita que os corpos embrionários se contentem por um minuto à temperatura ambiente, antes de aspirar o supernascente e suspender os corpos embrionários com meio E8 fresco para sua cultura em uma placa de Petri de 90 milímetros a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono até sua diferenciação.
Para diferenciação de queratinócito cbmc-iPSC, substitua o meio E8 da cultura corporal embrionária por um meio E8 fresco, complementado com um nanograma por mililitro de proteína morfogenética óssea 4 para uma incubação de 24 horas a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, colde os corpos embrionários em um tubo cônico de 50 mililitros, como demonstrado, e permita que os corpos se contentem por um minuto à temperatura ambiente. Em seguida, substitua o supernatante por seis mililitros de meio de diferenciação de queratinócito 1, ou KDM1, complementado com 10 inibidores de ROCK de micromolar, e transfira os corpos embrionários para um prato de 100 milímetros revestido de colágeno tipo IV.
Nos dias zero a oito da cultura, substitua o meio a cada dois dias por KDM1 fresco, complementado com ácido retinóico de três micromolares e 25 nanogramas por mililitro cada uma da proteína morfogenética 4 óssea e fator de crescimento epidérmico. Entre os dias nove e 12, substitua o meio a cada dois dias por KDM2, complementado com ácido retinóico de três micromolares, 25 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea 4, e 20 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico. Entre os dias 13 e 30, mude o meio a cada dois dias para KDM3, complementado com 10 nanogramas por mililitro de proteína morfogenética óssea 4, e 20 nanogramas por mililitro de fator de crescimento epidérmico.
Para diferenciação do fibroblasto CBMC-iPSC, suspenda a cultura do corpo embrionário em seis mililitros do meio de diferenciação do fibroblasto 1, suplementado com inibidor de ROCHA de 10 micromolares, e transfira a suspensão do corpo embrionário para um prato de 100 milímetros revestido de matriz de membrana de porão. Após três dias de incubação, trate a cultura com 0,5-nanomolar proteína morfogenética óssea 4 por quatro dias, antes de mudar o médio para o fibroblasto de diferenciação médio 2. No sétimo dia de cultura, mude o médio para FDM2 a cada dois dias por uma semana.
No dia 14 da cultura, desprendem as células com EDTA de um mililitro como demonstrado, e coletem as células em três mililitros de diferenciação de fibroblasto médio 2 para centrifugação. Suspenda as células em cinco mililitros de diferenciação de fibroblasto 1 para contagem, e transfira duas células de 10 para o sexto para um prato não revestido. No dia 21 da cultura, transfira duas vezes 10 para o sexto das células da cultura para um prato de 100 milímetros revestido de colágeno tipo I em meio de diferenciação de fibroblasto fresco 1.
No dia 28 da cultura, transfira duas vezes 10 para seis dos fibroblastos derivados do iPSC para um novo prato não revestido. Para a geração organoide da pele tridimensional, colde os fibroblastos derivados do iPSC da cultura, e transfira duas células de 10 para o quinto para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Suspenda a pelota do fibroblasto em 1,5 mililitros de fibroblasto médio 1, e 1,5 mililitros de solução neutralizada de Colágeno Tipo I.
Incubar as células em uma pastilha em uma microplacão de seis poços por 30 minutos à temperatura ambiente. Quando a solução se solidificar, adicione dois mililitros de médio ao topo da pastilha, e três mililitros na parte inferior do poço. Em seguida, coloque a matriz do fibroblasto na incubadora por cinco a sete dias, até que a gelação esteja completa, e a matriz não se contrai mais.
No final da incubação, colde os queratinócitos derivados do iPSC e transfira uma vez 10 para o sexto para um tubo cônico de 15 mililitros para centrifugação. Suspenda a pelota em 50 a 100 microlitadores de baixo nível epitelial de cálcio 1, e substitua o meio sobre a matriz do fibroblasto pela solução celular queratinócito. Após 15 minutos a 37 graus Celsius, substitua o médio na parte superior da inserção por dois mililitros de média epitelial 1, e o médio no poço inferior com três mililitros do mesmo, e devolva a placa à incubadora.
Após dois dias, substitua o meio na pastilha e o poço por meio epitelial de cálcio normal 2 por dois dias adicionais de cultura. No quarto dia de cultura, remova todo o meio e adicione três mililitros de meio de cornificação apenas para o fundo, para gerar uma interface ar-líquido. Em seguida, devolva a placa à incubadora por até 14 dias antes de colher o organoide de pele 3D para análise a jusante.
Os queratinócitos derivados do CBMC-iPSC têm morfologia semelhante aos queratinócitos primários, e a expressão de marcadores de queratinócitos é aumentada nessas células. Os fibroblastos derivados do CBMC-iPSC têm morfologia semelhante aos fibroblastos primários, e a expressão do marcador de células-tronco pluripotentes Oct-4 é regulada, enquanto os marcadores de fibroblasto são regulados. A espessura do organoide de pele 3D aumenta durante a cultura 3D, confirmando que o organoide de pele 3D é gerado a partir de queratinócitos e fibroblastos derivados do iPSC.
Após duas semanas, um enxerto organoide de pele 3D transplantado incorpora eficientemente em uma pele de rato receptora, como confirmado pela análise do HNE. Além disso, os marcadores de maturação e diferenciação epidérmica são expressos nos organoides de pele 3D derivados do CBMC-iPSC, demonstrando uma diferenciação funcional, enxerto eficiente e cicatrização eficaz dos defeitos da pele do camundongo. Usamos no passado com o alto meio de cálcio que induz camadas estratificadas de organoide de pele 3D para imitar perto da pele.
a análise mostra que a pele é estratificada. Os CBMC-iPSCs são uma fonte celular potencial para enxertos de pele, e organoides de pele 3D derivados do CBMC-iPSC podem ser usados em estudos relacionados à dermatologia, triagem cosmética e medicina regenerativa.
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