Developmental Biology
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Generación de 3D piel organoide de cable derivadas de sangre inducida por las células de vástago Pluripotent
Chapters
Summary April 18th, 2019
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Proponemos un protocolo que muestra cómo distinguir keratinocytes derivados de células madre pluripotentes inducidas y fibroblastos y generar un organoide de piel 3D, usando estos queratinocitos y fibroblastos. Este protocolo contiene un paso adicional de generar un modelo de ratones humanizados. La técnica presentada aquí mejorará la investigación dermatológica.
Transcript
Las células mononucleares de la sangre del cordón umbilical, o CBMC, han surgido como una fuente celular potencial para la medicina regenerativa, porque la tipificación de antígenos de leucocitos humanos es esencial para el sistema bancario celular. Las células madre pluripotentes inducidas por CBMC, o CMBC-iPSC, se pueden diferenciar en queratinocitos y fibroblastos. Para generar organoide cutáneo 3D, estamos usando investigación dermatológica.
Comience por cultivar CBMC-iPSC en placas de 100 mililitros recubiertas de vitronectina a 37 grados centígrados y 10% de dióxido de carbono. Cuando las células hayan alcanzado el 80% de confluencia, lave los cultivos con PBS y trátelos con un mililitro de EDTA de un mililitro durante dos minutos a 37 grados celsius y 5% dióxido de carbono. Cuando las células se hayan desprendido, detenga la reacción con tres mililitros de E8 medio por placa, y recoja las células por centrifugación.
Vuelva a suspender los pellets en cinco mililitros de medio E8 para el recuento, y transfiera de una a la sexta células a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación. Re-suspenda las células transferidas con 2,5 mililitros de medio de formación del cuerpo embrionario, complementados con quinasa asociada a rhomolar 10, o inhibidor de ROCK. Utilice una pipeta para transferir gotas de 125 microlitros de células a una tapa de placa de cultivo sin recubrimiento.
Cuando se hayan colocado todas las gotas, gire el plato para permitir que las gotas cuelguen de la tapa durante 24 horas a 37 grados centígrados y 5% de dióxido de carbono. Al día siguiente, lave la tapa con un medio E8 fresco y transfiera la solución del cuerpo embrionario a un tubo cónico de 50 mililitros. Permita que los cuerpos embrionarios se asienten durante un minuto a temperatura ambiente, antes de aspirar el sobrenadante y volver a suspender los cuerpos embrionarios con medio E8 fresco para su cultivo en un plato Petri de 90 milímetros a 37 grados centígrados y 5% dióxido de carbono hasta su diferenciación.
Para la diferenciación de queratinocitos CBMC-iPSC, sustituya el medio E8 del cultivo del cuerpo embrionario por un medio E8 fresco, complementado con un nanograma por mililitro de proteína morfogenética ósea 4 para una incubación de 24 horas a 37 grados Celsius y 5% dióxido de carbono. Al día siguiente, cosecha los cuerpos embrionarios en un tubo cónico de 50 mililitros como se ha demostrado, y permite que los cuerpos se asienten durante un minuto a temperatura ambiente. A continuación, reemplace el sobrenadante con seis mililitros de medio de diferenciación de queratinocitos 1, o KDM1, complementado con 10 inhibidores de ROCK micromolar, y transfiera los cuerpos embrionarios a un plato de 100 milímetros recubierto de colágeno tipo IV.
En los días cero a ocho del cultivo, reemplace el medio cada dos días con KDM1 fresco, complementado con ácido retinoico de tres micromolares y 25 nanogramos por mililitro cada uno de la proteína morfogenética ósea 4 y factor de crecimiento epidérmico. Entre los días nueve a 12, reemplace el medio cada dos días con KDM2, complementado con ácido retinoico de tres micromolares, 25 nanogramos por mililitro de proteína morfogenética ósea 4, y 20 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento epidérmico. Entre los días 13 a 30, cambie el medio cada dos días a KDM3, complementado con 10 nanogramos por mililitro de proteína morfogenética ósea 4, y 20 nanogramos por mililitro de factor de crecimiento epidérmico.
Para la diferenciación de fibroblastos CBMC-iPSC, re-suspenda el cultivo del cuerpo embrionario en seis mililitros de medio de diferenciación de fibroblastos 1, complementado con inhibidor de 10 micromolares ROCK, y transfiera la suspensión del cuerpo embrionario a una antena de 100 milímetros recubierta de matriz de membrana de sótano. Después de tres días de incubación, tratar el cultivo con 0,5-proteína morfogenética ósea nanomolar 4 durante cuatro días, antes de cambiar el medio a medio de diferenciación de fibroblastos 2. En el séptimo día de cultura, cambie el medio a FDM2 cada dos días durante una semana.
En el día 14 del cultivo, separar las células con un EDTA unlilolar como se ha demostrado, y recoger las células en tres mililitros de medio de diferenciación de fibroblastos 2 para la centrifugación. Re-suspenda las células en cinco mililitros de medio de diferenciación de fibroblastos 1 para contar, y transfiera dos veces-10 a la sexta células a un plato no recubierto. En el día 21 del cultivo, transfiera dos veces a la sexta células del cultivo a un plato de 100 milímetros recubierto de colágeno tipo I en un medio de diferenciación de fibroblastos frescos 1.
En el día 28 del cultivo, transfiera dos veces a los seis de los fibroblastos derivados del iPSC a un nuevo plato no recubierto. Para la generación de organoides de piel tridimensionales, cosecha los fibroblastos derivados del iPSC del cultivo y transfiere dos veces-10 a la quinta célula a un tubo cónico de 15 mililitros para la centrifugación. Vuelva a suspender el pellet de fibroblastos en 1,5 mililitros de medio de diferenciación de fibroblastos 1 y 1,5 mililitros de solución de colágeno de tipo I neutralizada.
Incubar las células en un inserto en una microplaca de seis pomos durante 30 minutos a temperatura ambiente. Cuando la solución se haya solidificado, añada dos mililitros de medio a la parte superior de la plaquita y tres mililitros en la parte inferior del pozo. A continuación, coloque la matriz de fibroblastos en la incubadora durante cinco a siete días, hasta que la geleración esté completa y la matriz ya no se contraiga.
Al final de la incubación, cosecha los queratinocitos derivados del iPSC, y transfiere una-vez-10-a-la sexta células a un tubo cónico de 15 mililitros para centrifugación. Vuelva a suspender el pellet en 50 a 100 microlitros de medio epitelial bajo en calcio 1, y reemplace el medio sobre la matriz de fibroblastos por la solución de células de queratinocitos. Después de 15 minutos a 37 grados centígrados, reemplace el medio en la parte superior de la plaquita con dos mililitros de medio epitelial 1, y el medio en el pozo inferior con tres mililitros de la misma, y devuelva la placa a la incubadora.
Después de dos días, reemplace el medio en el inserto y el pozo con medio epitelial de calcio normal 2 durante dos días adicionales de cultivo. En el cuarto día de cultivo, retire todo el medio, y agregue tres mililitros de medio de cornificación al fondo bien solamente, para generar una interfaz aire-líquido. A continuación, devuelva la placa a la incubadora hasta 14 días antes de cosechar el organoide cutáneo 3D para el análisis posterior.
Los queratinocitos derivados de CBMC-iPSC tienen morfología similar a los queratinocitos primarios, y la expresión de marcadores de queratinocitos aumenta en estas células. Los fibroblastos derivados de CBMC-iPSC tienen morfología similar a los fibroblastos primarios, y la expresión del marcador de células madre pluripotentes Oct-4 está regulada hacia abajo, mientras que los marcadores de fibroblastos están regulados hacia arriba. El grosor del organoide cutáneo 3D aumenta durante el cultivo 3D, lo que confirma que el organoide cutáneo 3D se genera a partir de queratinocitos y fibroblastos derivados de iPSC.
Después de dos semanas, un injerto organoide cutáneo 3D trasplantado se incorpora eficientemente en la piel de un ratón receptor, como lo confirma el análisis de HNE. Además, los marcadores de maduración de queratinocitos y diferenciación epidérmica se expresan en los organoides de la piel 3D derivados de CBMC-iPSC, lo que demuestra una diferenciación funcional, injerto eficiente y curación eficaz de los defectos de la piel del ratón. Utilizamos en el pasado con el medio de calcio alto que induce capas estratificadas de organoide cutáneo 3D para imitar cerca de la piel.
análisis muestra que la piel está estratificada. Los CBMC-iPSC son una fuente celular potencial para los injertos de piel, y los organoides cutáneos 3D derivados de CBMC-iPSC se pueden utilizar en estudios relacionados con la dermatología, el cribado cosmético y la medicina regenerativa.
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