Developmental Biology
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Generation av 3D hud Organoid från sladd blod-derived inducerade pluripotenta stamceller
Chapters
Summary April 18th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Vi föreslår ett protokoll som visar hur att skilja inducerade pluripotenta stamceller-derived keratinocyter och fibroblaster och generera en 3D hud organoid, använda dessa keratinocyter och fibroblaster. Detta protokoll innehåller ytterligare ett steg för att generera en humaniserade möss modell. Tekniken presenteras här kommer förbättra Dermatologisk forskning.
Transcript
Navelsträngsblod mononukleära celler, eller CBMC, har uppstått som en potentiell cellkälla för regenerativ medicin, eftersom mänskliga leukocyte antigenet skriva är viktigt att cellen banksystemet. CBMC-inducerad pluripotenta stamceller, eller CMBC-iPSCs, kan differentieras till keratinocyter och fibroblaster. För att generera 3D-hudorganoid använder vi dermatologisk forskning.
Börja med att kultförklara CBMC-iPSC på vitronectin-belagda 100-milliliter plattor vid 37 grader Celsius och 10%koldioxid. När cellerna har nått 80%konfluency, tvätta kulturerna med PBS, och behandla dem med en milliliter av en millimolar EDTA per platta i två minuter vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. När cellerna har lossnat, stoppa reaktionen med tre milliliter E8 medium per platta, och samla cellerna genom centrifugeringen.
Åter upphäva pellets i fem milliliter av E8 medium för räkning, och överföra en gång-10-till-sjätte celler till en 15-milliliter konaltrör för centrifugeringen. Åter upphäva de överförda cellerna med 2,5-milliliter av embryonala kroppsbildning medium, kompletterat med 10-mikromolar rho-associerade kinas, eller ROCK-hämmare. Använd en pipett för att överföra 125-mikroliter droppar av celler på en obestruken kultur tallrik lock.
När alla droppar har placerats, vänd på skålen så att dropparna att hänga från locket i 24 timmar vid 37 grader Celsius och 5% koldioxid. Nästa dag, tvätta locket med färskt E8 medium, och överföra embryonala kroppslösningen till en 50-milliliter konisk rör. Låt embryonala kroppar att nöja sig med en minut i rumstemperatur, innan aspirera supernatant och åter avbryta embryonala kroppar med färskt E8 medium för sin kultur i en 90-millimeters Petriskål vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid tills deras differentiering.
För CBMC-iPSC keratinocyte differentiering, ersätta E8-mediet från den embryonala kroppen kultur med färskt E8 medium, kompletteras med ett nanogram per milliliter av ben morfogent protein 4 för en 24-timmars inkubation vid 37 grader Celsius och 5%koldioxid. Nästa dag, skörda embryonala kroppar i en 50-milliliter koniska rör som visas, och låt kropparna att nöja sig med en minut i rumstemperatur. Därefter ersätter supernatanten med sex milliliter av keratinocyte differentieringsmedium 1, eller KDM1, kompletterat med 10 mikromolar ROCK-hämmare, och överför embryonala kroppar till en typ IV Kollagen-belagd 100-millimeters skål.
På dag noll genom åtta av kultur, ersätta mediet varannan dag med färska KDM1, kompletteras med tre-mikromolar retinoinsyra och 25 nanogram per milliliter vardera av ben morphogenetic protein 4 och epidermal tillväxtfaktor. Mellan dag nio till 12, ersätta mediet varannan dag med KDM2, kompletterad med tre-mikromolar retinoinsyra, 25 nanogram per milliliter benmorfogent protein 4, och 20 nanogram per milliliter av epidermal tillväxtfaktor. Mellan dag 13 till 30, ändra mediet varannan dag till KDM3, kompletterad med 10 nanogram per milliliter benmorfogetiskt protein 4, och 20 nanogram per milliliter av epidermal tillväxtfaktor.
För CBMC-iPSC fibroblast differentiering, åter upphäva embryonala kroppen kultur i sex milliliter fibroblast differentiering medium 1, kompletteras med 10-mikromolar ROCK-hämmare, och överföra embryonala kroppen suspension till en källare membran matris-belagda 100-millimeters skålen. Efter tre dagars inkubation, behandla kulturen med 0,5-nanomolar benmorfogetiskt protein 4 i fyra dagar, innan du ändrar medium till fibroblast differentiering medium 2. På dag sju av kultur, ändra mediet till FDM2 varannan dag i en vecka.
På dag 14 av kultur, lossa cellerna med en millimolar EDTA som visats, och samla cellerna i tre milliliter av fibroblast differentiering medium 2 för centrifugeringen. Åter avbryta cellerna i fem milliliter fibroblast differentiering medium 1 för räkning, och överföra två gånger-10-till-sjätte celler till en icke-belagd maträtt. På dag 21 av kultur, överföra två gånger-10-till-sjätte celler från kulturen till en typ I Kollagen-belagda 100-millimeters maträtt i färsk fibroblast differentiering medium 1.
På dag 28 av kultur, överföra två gånger-10-till-den-sex av iPSC-härledda fibroblaster till en ny icke-belagda skålen. För tredimensionell hud organoid generation, skörda iPSC-härledda fibroblaster från kultur, och överföra två gånger-10-till-den-femte celler till en 15-milliliter koniska röret för centrifugeringen. Re-suspendera fibroblast pellet i 1,5 milliliter av fibroblast differentiering medium 1, och 1,5 milliliter av neutraliserade typ I kollagen lösning.
Inkubera cellerna på ett skär i en sex-väl mikroplatta i 30 minuter vid rumstemperatur. När lösningen har stelnat, tillsätt två milliliter medium till toppen av skäret, och tre milliliter till botten av brunnen. Placera sedan fibroblastmatrisen i inkubatorn i fem till sju dagar, tills gelationen är klar, och matrisen inte längre kontrakt.
I slutet av inkubationen, skörda iPSC-härledda keratinocyter, och överföra en gång-10-till-sjätte celler till en 15-milliliter koniska röret för centrifugeringen. Åter upphäva pelleten i 50 till 100 mikroliter av låg kalcium epitelial medium 1, och ersätta mediet över fibroblast matris med keratinocyte celllösning. Efter 15 minuter vid 37 grader Celsius, byt ut mediet i toppen av skäret med två milliliter epitelial medium 1, och mediet i botten väl med tre milliliter av samma, och tillbaka plattan till inkubatorn.
Efter två dagar, byt ut mediet i skäret och brunnen med normal kalciumepitel medium 2 för ytterligare två dagar av kultur. På dag fyra av kultur, ta bort alla medium, och tillsätt tre milliliter av cornification medium till botten väl bara, för att generera en luft-flytande gränssnitt. Sedan tillbaka plattan till inkubatorn i upp till 14 dagar innan skörd 3D hud organoid för nedströms analys.
CBMC-iPSC-härledda keratinocyter har morfologi som liknar primära keratinocyter, och uttrycket av keratinocyte markörer ökas i dessa celler. CBMC-iPSC-härledda fibroblaster har morfologi som liknar primära fibroblaster, och uttrycket av pluripotenta stamceller markör Okt-4 är ned-reglerad, medan fibroblast markörer är upp-reglerad. Tjockleken på 3D-huden organoid ökar under 3D-kultur, bekräftar att 3D-huden organoid genereras från iPSC-härledda keratinocyter och fibroblaster.
Efter två veckor, en transplanterad 3D hud organoid transplantat effektivt införlivar i en mottagare mus hud, vilket bekräftas av HNE analys. Vidare är keratinocyter mognad och epidermal differentiering markörer uttrycks i den CBMC-iPSC-härledda 3D hud organoider, visar en funktionell differentiering, effektiv ympning och effektiv läkning av musen huden defekter. Vi använder tidigare med hög kalcium medium som inducerar stratifierade lager av 3D hud organoid att efterlikna nära huden.
analys visar att huden stratifieras. CBMC-iPSCs är en potentiell cellkälla för hudtransplantat, och CBMC-iPSC-härledda 3D hudorganoider kan användas i studier relaterade till dermatologi, kosmetisk screening, och regenerativ medicin.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
