Bioengineering
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गर्मी और दबाव का उपयोग कर जलीय विलायक के माध्यम से पुनः संयोजक मकड़ी Silks की सामग्री गठन
Chapters
Summary May 6th, 2019
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यहां, हम पानी में घुलनशील पुनः संयोजक मकड़ी रेशम प्रोटीन समाधान और सामग्री रूपों है कि उन समाधानों से गठित किया जा सकता उत्पादन करने के लिए एक प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं ।
Transcript
पुनर्संयोजन मकड़ी रेशम को घुलनशील बनाने की यह विधि सामग्री रूपों का उत्पादन करती है जो पारंपरिक कठोर कार्बनिक सॉल्वैंट्स का उपयोग करके संभव नहीं है। इसके अलावा, प्रक्रिया अनाज है, जिसके परिणामस्वरूप पानी में एक सरल प्रोटीन समाधान होता है। इस विधि का उपयोग करके, बनाई या उत्पादित सामग्री मकड़ी रेशम प्रोटीन की वांछनीय विशेषताओं को बनाए रखते हैं।
पुनर्संयोजन मकड़ी रेशम के लिए यह घुलनशीलीकरण तकनीक एक कदम प्रक्रिया में पुनर्संयोजन मकड़ी रेशम के घुलनशीलीकरण के लिए अनुमति देती है। यह वांछनीय है क्योंकि इन कुख्यात प्रोटीन का उत्पादन करने के लिए मुश्किल व्यापक प्रसंस्करण के माध्यम से खो नहीं रहे हैं । इसके अलावा, चूंकि समाधान पानी में सिर्फ प्रोटीन हैं, इसलिए यदि आवेदन के लिए वांछनीय है तो अन्य जैविक रूप से सक्रिय यौगिकों को जोड़ा जा सकता है।
विशेष रूप से, प्रोटीन संरचना समारोह संबंध, यह प्रणाली कैसे एक मकड़ी में एक फाइबर बनाता है कि यह एक उच्च एकाग्रता पर पानी और प्रोटीन का उपयोग करता है memetic है । इस घुलनशीलता विधि और बाद में सामग्री गठन का उपयोग करके, बनने वाली सामग्रियों और उनके लिए जिम्मेदार संरचनाओं में समझ हासिल करना संभव होना चाहिए। यह सोचा है कि यह हो सकता है, हम सिंथेटिक पेप्टाइड्स है कि अंयथा एक क्षारीय या अम्लीय वातावरण को सुलझाने की आवश्यकता होगी घुलनशील के लिए इस तकनीक का इस्तेमाल किया है ।
यह उन पेप्टाइड्स के लिए डाउनस्ट्रीम अनुप्रयोगों में लाभप्रद हो सकता है । इसके अलावा, ज्ञात प्रोटीन के एक नंबर जब कृत्रिम रूप से व्यक्त करने के लिए अघुलनशील अंश में खत्म हो जाते हैं । फिर से दोगुना, और फिर इन प्रोटीन को फिर से दोगुना करना अक्सर एक श्रमसाध्य प्रक्रिया होती है जिसके परिणामस्वरूप बड़े नुकसान होते हैं।
इस तकनीक का उपयोग करके, अघुलनशील प्रोटीन के लिए वसूली प्रक्रियाओं की दक्षता में वृद्धि करना संभव हो सकता है। एक माइक्रोवेव में एक सील शीशी रखने थोड़ा ओवरहीटिंग का जोखिम दे कठिन है और इस तरह शीशी दबाव पर । गर्मी और दबाव लागू करने के लिए मंचन दृष्टिकोण को समझना महत्वपूर्ण है ।
दूसरा, विशेष रूप से पुनर्संयोजन मकड़ी रेशम के लिए, नमक मौजूद होने से तकनीक को काम करने या प्रभावी रूप से काम करने की अनुमति नहीं होगी जो इस बात पर निर्भर करता है कि नमक कितना मौजूद है। नमक हटाने की कुंजी है। धैर्य और सावधान रहें, शीशी के अंदर अपने माइक्रोवेव समय और तापमान की बारीकी से निगरानी करें।
यह महत्वपूर्ण है क्योंकि ऑपरेशन के लिए कई चलती भाग हैं जिन्हें अक्सर पारंपरिक लिखित सामग्रियों और विधि वर्गों के माध्यम से व्यक्त करना मुश्किल होता है। यह देखते हुए कि ऐसे कई प्रोटीन हैं जिनमें घुलनशीलता की समस्याएं हैं जो पर्याप्त अध्ययन को रोकती हैं, इस विधि में सुधार करने के लिए विभिन्न प्रकार के प्रोटीन रिक्त स्थानों में लागू होने की क्षमता है, या यहां तक कि विश्लेषणात्मक तकनीकों और लक्षण वर्णन की अनुमति भी है। शुरू करने के लिए, एक रबर लाइन वाले स्क्रू कैप के साथ एक स्वच्छ और नए आठ मिलीलीटर ऑटोक्लेवेबल बोरोसिलिकेट ग्लास संस्कृति शीशी का चयन करें, और खाली शीशी को विश्लेषणात्मक संतुलन पर रखें।
खाली शीशी के द्रव्यमान को फाड़ दें ताकि शेष शून्य द्रव्यमान पढ़ता हो। विशिष्ट सामग्री के लिए खाली शीशी में वांछित लियोफिलाइज्ड रिकॉम्बिनेंट स्पाइडर सिल्क प्रोटीन पाउडर जोड़ें। फिर, शीशी में कम से कम दो मिलीलीटर, अल्ट्रा शुद्ध पानी की वांछित मात्रा जोड़ें।
शीशी टोपी को सील करें, और एक फैलाए हुए और समरूप पुनर्संयोजन मकड़ी रेशम प्रोटीन मिश्रण बनाने के लिए सामग्री को तेज रूप से भंवर। यह सुनिश्चित करने के लिए शीशी टोपी की अंतिम जांच करें कि इसे दृढ़ता से और सुरक्षित रूप से कड़ा किया गया है। फिर, निलंबित पुनर्संयोजन मकड़ी रेशम प्रोटीन मिश्रण को 700 से 1500 वाट की पावर रेंज के साथ पारंपरिक माइक्रोवेव ओवन में स्थानांतरित करें।
पांच सेकंड के फटने के साथ माइक्रोवेव का संचालन शुरू मैन्युअल रूप से चालू और बंद करके पूरी शक्ति निर्धारित करें। प्रत्येक फटने के बाद, संक्षेप में दरवाजा खोलें, और बसने से रोकने के लिए शीशी को सावधानी से मिलाएं, और निलंबित मिश्रण को बनाए रखें। कभी-कभी शीशी और समाधान को ठंडा करने की अनुमति दें, और अतिहीत समाधान को सील को छूने से रोकें।
शीशी के हिस्से वाले समाधान के तापमान को मापने के लिए एक अवरक्त थर्मामीटर का उपयोग करें। माइक्रोवेव प्रक्रिया को तब तक दोहराएं जब तक तापमान कम से कम 130 डिग्री सेल्सियस तक न पहुंच जाए, और सभी ठोस कण पूरी तरह से भंग हो गए हैं। फिर, समाधान के तापमान और शीशी टोपी को 100 डिग्री सेल्सियस से नीचे ठंडा करने दें।
इस समाधान को पूरी तरह से ठंडा करने से पहले, इसे शीशी से एक हाइड्रोगेल बनाने के लिए विशिष्ट ज्यामिति में डालें। हाइड्रोजेल बनने के बाद, इसे पानी के स्नान में रखें, और इसे शून्य से 20 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीजर में स्थानांतरित करें। स्नान पूरी तरह से जमे हुए है जब तक रुको।
फ्रीजर से जमे हुए हाइड्रोगेल और पानी के स्नान को हटाकर स्पंज गठन की प्रक्रिया को पूरा करें, और 25 डिग्री सेल्सियस पर विगलन करें। फिर, गल गए पानी से परिणामी स्पंज निकालें। एक लियोगेल तैयार करने के लिए, एक जमे हुए हाइड्रोगेल नमूने को एक लियोफिलिज़र में स्थानांतरित करें।
24 घंटे के बाद, पोत से अंतिम रूप से ल्योफिलाइज्ड जेल सामग्री निकालें। पुनर्संयोजन मकड़ी रेशम प्रोटीन की फिल्मों का उत्पादन करने के लिए, गर्म घुलनशील रिकॉम्बिनेंट स्पाइडर सिल्क प्रोटीन के 200 माइक्रोलीटर को शीशी से वांछित आकार के पीडीएमएस रूप पर कास्ट करें। सूखने के बाद, इसे परीक्षण या उपचार के लिए पीडीएमएस सब्सट्रेट से छील लें।
एक कोटिंग तैयार करने के लिए जिसे सब्सट्रेट से हटाया नहीं जा सकता है, पसंद के सब्सट्रेट पर प्रारंभिक स्प्रे कोटिंग करने के लिए घुलनशील रिकॉम्बिनेंट स्पाइडर सिल्क प्रोटीन को लागू करने के लिए एयरब्रश स्प्रेयर का उपयोग करें। सूखने के बाद, डिप कोटिंग बनाने के लिए कोटेड सब्सट्रेट को घुलनशील रिकॉम्बिनेंट स्पाइडर सिल्क प्रोटीन में डुबो दें। वांछित मोटाई प्राप्त करने के लिए डुबकी कोटिंग दोहराएं।
चिपकने वाले बनाने के लिए, एक सब्सट्रेट पर घुलनशील रिकॉम्बिनेंट स्पाइडर सिल्क प्रोटीन जोड़ने के लिए एक पिपेट का उपयोग करें, और फिर समाधान के शीर्ष पर एक दूसरा सब्सट्रेट लागू करें। मजबूती से टुकड़ों को एक साथ दबाएं, और फिर कम से कम 16 घंटे के लिए 25 डिग्री सेल्सियस के न्यूनतम तापमान के साथ एक ओवन में नमूनों को सुखा लें। गीले काता फाइबर उत्पन्न करने के लिए, 19 गेज ग्लाइड सुई का उपयोग करें, और एक ल्यूयर लॉक टिप के साथ एक गाढ़ा सिरिंज में घुलनशील डोप समाधान लोड करें।
हवा के बुलबुले को बाहर निकालें, और डोप को सिरिंज के लूयर लॉक एंड पर बैठने दें। 16 इंच बाहरी व्यास पर एक के लिए तिरछी टयूबिंग के एक टुकड़ा उंगली तंग फिटिंग में झांकना टयूबिंग के कम से 25 मिलीमीटर डालें, और 10 से अधिक ३२ कंघी । सिरिंज के लूयर लॉक महिला एडाप्टर पर इस सेटअप के साथ 19 गेज सुई को बदलें।
फिर, मध्यवर्ती गोडेट्स के बाहर नाइट्रिल दस्ताने रखें, फाइबर को फिसलने से उत्पन्न होने के लिए रखें, और मोटर्स को नुकसान पहुंचाने से बचने के लिए। एक जमावट स्नान के रूप में उपयोग करने के लिए 99% शुद्ध आइसोप्रोपैनॉल के साथ एक लंबा स्पष्ट ग्लास स्नान प्राप्त करें। आइसोप्रोपैनॉल और आसुत पानी के 80 से 20 अनुपात के साथ पहले स्ट्रेच बाथ को भरें।
दूसरे स्ट्रेच बाथ में आइसोप्रोपेनॉल और डिस्टिल्ड वॉटर का 20 से 80 रेशियो भरें। कंप्यूटर पर गोडेट स्ट्रेच सिस्टम सेट करें। फाइबर हटाने की मुख्य गति को समायोजित करने के लिए, गोडेट ट्रिपल ए गति के लिए फिसलने वाले बार को 10 से 14 मिलीमीटर प्रति सेकंड के बीच एक मूल्य पर समायोजित करें, यह इस बात पर निर्भर करता है कि फाइबर कितनी अच्छी तरह और जल्दी से बन रहा है।
स्ट्रेच बाथ वन, मिडिल अपर गोडेट और स्ट्रेच बाथ दो में पहला गोडेट में अंतिम गोडेट के लिए गोडेट ट्रिपल बी स्ट्रेच रेशियो के स्लाइडिंग बार को दो तक ले जाकर पहला स्ट्रेच शुरू करें । स्ट्रेच बाथ दो, लास्ट अपर गोडेट और विंडर में अंतिम गोडेट के लिए गोडेट ट्रिपल सी स्ट्रेच रेशियो के स्लाइडिंग बार को दो तक ले जाकर दूसरे स्ट्रेच को शुरू करें । यह सेटअप यह सुनिश्चित करता है कि जमावट स्नान के बाद पहला गोडेट, और पहले खिंचाव स्नान में पहला गोडेट उसी गति से घूर्णन कर रहे हैं।
इसके बाद, एक कस्टम स्पिन लाइन इंस्ट्रूमेंट की सिरिंज में रेशम समाधान लोड करें। स्वचालित प्रणाली में, एक्सट्रूशन दर को 10 मिलीमीटर प्रति सेकंड तक सेट करें, ताकि रेशम के समाधान को आइसोप्रोपेनॉल से भरे ग्लास जमावन स्नान में निकाला जा सके। फाइबर निकालने की अनुमति दें एक पतली धातु हुक के साथ स्नान से बाहर फाइबर खींचने से पहले, वर्दी बनने के लिए।
सत्यापित करें कि स्नान से फाइबर को हटाने से तिरछी टयूबिंग टिप और स्नान छोड़ने वाले फाइबर के रास्ते के बीच एक पाश बनाता है। गोडसे की श्रृंखला के माध्यम से प्राप्त फाइबर का मार्गदर्शन करें, जैसे कि फाइबर खिंचाव स्नान में डूबा हुआ है, लेकिन खिंचाव स्नान के बीच हवा में सूख रहा है, और एक स्पूल पर जाने से पहले। इस प्रोटोकॉल में पुनर्संयोजन मकड़ी रेशम प्रोटीन के घुलनशीलता के माध्यम से, विभिन्न प्रकार के भौतिक रूपों को प्राप्त किया जा सकता है।
यहां सात सामग्री रूप प्रस्तुत किए जाते हैं। हाइड्रोगेल, ल्योजेल, स्पंज, चिपकने वाला, कोटिंग्स, फिल्में और फाइबर। फाइबर एक जमाना स्नान में बाहर निकालने के द्वारा सबसे व्यापक प्रसंस्करण की आवश्यकता है, और फिर क्रमिक रूप से पोस्ट बिन खिंचाव स्नान में कच्चे फाइबर खींच ।
यह देखते हुए कि प्रोटीन और पानी के समाधान अपेक्षाकृत उच्च तापमान और दबाव के लिए गर्म कर रहे हैं, हमारा अनुभव रहा है कि समाधान बिंदु प्रोटीन हल है पर बाँझ हैं । यह सामग्री के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया का अध्ययन करने के लिए, जब तक उन्हें उचित रूप से संभाला जाता है, तब तक यहां प्रस्तुत किसी भी सामग्री रूप को सेल संस्कृति में ले जाने की अनुमति देता है। निश्चित रूप से इस तकनीक ने चिपकने वाले और स्पंज सामग्री सहित नए सामग्री रूपों की खोज की है।
सामग्री रूप जो फाइबर गठन की ओर आवश्यक रूप से केंद्रित नहीं हैं, हालांकि फाइबर गठन उन क्षेत्रों में से एक है जिन्होंने इस तकनीक के विकास के माध्यम से सुधार भी देखा है। एक सीलीय शीशी के अंदर गर्मी और दबाव पैदा करने से अंतर्निहित खतरा है। इन प्रक्रियाओं को करते समय हमेशा व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण पहनें।
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