Immunology and Infection
This content is Open Access.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Mänskliga Colonoid enskiktslager att studera interaktioner mellan patogener, förknippas och värd Intestinal epitel
Summary April 9th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Här presenterar vi ett protokoll till kultur mänskliga enteroid eller colonoid enskiktslager som har intakt barriär-funktion att studera värd epitelial-bakterieflora interaktioner på cell- och biokemisk nivå.
Transcript
3D intestinal organoid kultur begränsar studiet av värd epitelial-patogen interaktion eftersom lumen inte är direkt tillgänglig för bakterier eller virulensfaktorer. Dessutom kan utsöndrar material som små molekyler, proteiner eller slem lätt tas till prov från 3D-kulturen för nedströms analys. För att ta itu med dessa begränsningar presenterar vi ett modifierat protokoll för konvertering av 3D mänskliga enteroids eller colonoids till en monolayer.
Colonoid monolayers utsöndrar en tjock, apikala slem skikt, vilket möjliggör ex vivo studier av patogen-slem interaktion. Denna metod syftar till att ge en tractable modell för att studera de tidigaste intestinala värd-patogen interaktioner vid infektion. Colonoid monolayers kommer att möjliggöra ett nytt sätt att studera slem biologi, vilket är viktigt i host-patogen interaktion, mikrobiomet studier, och inflammatorisk tarmsjukdom.
Denna metod kan tillämpas på andra slem-utsöndring organ såsom övre GI-tarmkanalen, andningsorgan, och kvinnliga reproduktiva systemet. Visuell demonstration kommer att hjälpa användaren med slem bevarande under monolayer tillväxt och under fixering för immunfärgning. Demonstrerar proceduren blir Karol Dokladny, en personalforskare från vårt laboratorium.
Efter inkuberade den belagda cellkulturen aspirera odlingsmediet från 24-brunnsplattan och ersätt med en milliliter iskall skördelösning per brunn. Använd en mini cell skrapa för att rubba och bryta upp källaren membran matris pellet. Var särskilt uppmärksam på allt material nära brunnskanterna.
Sedan agitera plattan på en orbital shaker vid cirka 200 varv per minut vid fyra grader Celsius i 30 till 45 minuter. Använd en P200-pipett med en kanal försedd med sterila filterspetsar för att triturtera cellupphängningen. Leverera cellupphängningen i en 15-milliliter konisk injektionsflaska.
Använd flera injektionsflaska om total suspensionsvolym är större än sex milliliter. Därefter, lägg i injektionsflaskan en lika stor volym av Advanced DMEM/F12 medium som innehåller 10 millimolar HEPES, L-alanyl-L-glutamin dipeptid, och penicillin-streptomycin. Det här är tvättmediet.
Invertera injektionsflaskan tre till fyra gånger för att blanda. Centrifug vid 300 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius. Före cellpläteringen skall de belagda inläggen i en vävnadskulturinkubator i minst 30 minuter ekvilka.
För varje skär som ska pläterad, varm en milliliter expansion medium i en 37-graders-Celsius vattenbad och tillsätt två hämmare. Tillsätt sedan blandningen till brunnarna. Aspirera tvättmediet från det rör som innehåller cellpelleten och ersätt med expansionsmedium med en volym som är tillräcklig för att ge minst 100 mikroliter per insats och återanvändande medel.
Därefter aspirera kollagen IV-lösningen från varje insats och tvätta två gånger med 150 mikroliter av tvättmediet per insats. Pipett 600 mikroliter expansionsmedium i utrymmet under varje skär. Pipett 100 mikroliter cellupphängning från injektionsflaskan in i varje skär.
Lämna tillbaka plattan till vävnadskulturinkubatorn och lämna ostört i minst 12 timmar. Undvik att skaka eller kraftigt luta plattan. Efter inkubering, placera plattan på en fas kontrast ljusmikroskop med en 2,5 gånger till 10 gånger objektiv.
Uppdatera med odlingsmedium utan hämmare för att avbryta hämningsbehandlingen. Fortsätt att uppdatera mediet varannan till var tredje dag tills det konfluent. Lyft cellodlingsinsatserna från 24-brunnsplattan med finspetsade pincett eller pincett.
Försiktigt invertera på ett laboratorium silkespapper för att ta bort det apikala mediet och torka bort extern vätska som klamrar sig fast vid insatsen. I en ny 24-brunnsplatta, sänk inläggen i en en till tre lösning av glacial ättiksyra och absolut etanol i 10 minuter vid rumstemperatur. Sedan, på bänken, invertera insatsen på silkespapper för att ta bort fixativet.
Placera skären i en plastbehållare fylld med 1X PBS i 10 minuter för att rehydrera cellerna innan du fortsätter med vanliga immunfärgningsprotokoll. För att bevara, använd ett rakblad för att skära runt omkretsen av skärhinnan. Med hjälp av tuppar, överföra membranet till ett glas mikroskop slide.
Lägg sedan till monteringsmediet och fäst ett täckglas. I detta experiment, mänskliga enteroid och colonoid kulturer odlas som 3D-strukturer, sedan dissocierade och fragmenterade för plätering på människa-kollagen-IV-belagda cellodlingar. Förloppet av monolayerbildning övervakas dagligen via ljusfältsmikroskopi och immunofluorescensfärgning.
Colonoid fragment seedade på människa-kollagen-IV-belagda filter bildar en multipel monolayer öar två till fyra dagar efter sådd. Både maximal intensitet projektion och confocal optiska Z-avsnitt med motsvarande ortogonala prognoser visar att cellfria områden är identifierbara genom avsaknad av både nukleära och apikala F-aktin färgning. En confluent colonoid monolayer med kontinuerlig apikala yta upptäcktes genom F-aktin immunostaining ungefär en vecka post-seeding.
Hög förstoring av en representativ maximal intensitet projektion och confocal optiska avsnitt med motsvarande ortogonala prognoser visar att celler i confluent colonoid monolayers bildar F-aktin perijunctional ringar och en omogen apikal pensel gränsen. EdU införlivande visar en progressiv förlust av spridning under jejunal monolayer differentiering. Odifferentierade jejunal monolayers har bredare, kortare celler, och en mindre mogen apikal aktin-baserade pensel gränsen jämfört med jejunal monolayers efter fem dagars differentiering.
Att splittra kolonoiderna är kritiskt. Om fragmenten är för stora, kommer de inte att fästa vid det belagda filtret, utan kommer istället att reformera till en 3D-colonoid. Vi presenterade en modifierad metod för att studera slem biologi på colonoid monolayers.
Andra värd-patogenstudier kan utföras för att titta på samspelet mellan patogenen och den intestinala apikala ytan.
Please enter your institutional email to check if you have access to this content
has access to
BackLogin to access JoVE
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
To receive a free trial, please fill out the form below.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You
Thank You
Thank You
