Genetics
A subscription to JoVE is required to view this content.
You will only be able to see the first 2 minutes.
The JoVE video player is compatible with HTML5 and Adobe Flash. Older browsers that do not support HTML5 and the H.264 video codec will still use a Flash-based video player. We recommend downloading the newest version of Flash here, but we support all versions 10 and above.
If that doesn't help, please let us know.
Kromatin immunoprecipitation analys med hjälp av Micrococcal nukleaser i däggdjursceller
Chapters
Summary May 10th, 2019
Please note that all translations are automatically generated.
Click here for the English version.
Kromatin immunoprecipitation (ChIP) är ett kraftfullt verktyg för att förstå de molekylära mekanismerna för genreglering. Metoden innebär dock svårigheter att få reproducerbar kromatinfragmentering genom mekanisk klippning. Här ger vi ett förbättrat protokoll för en ChIP-analys med enzymatisk matsmältning.
Transcript
I detta protokoll kan vi identifiera samspelet mellan proteiner och DNA, avslöjar transkriptional reglering av genen. Detta hjälper till att förstå de molekylära mekanismerna i cellerna. Vi ändrar de redan existerande protokollen och upprättar sedan ett okomplicerat och tydligare analysprotokoll.
Du bara helt enkelt följa protokollet från det första steget så att analysen kan göras med framgång. För att förbereda crosslinked kromatin, i en rök huva, tillsätt fyra milliliter av 1%VCaP cellodling media och 0,229 milliliter på 18,5%PFA till en sex centimeter maträtt. Snurra försiktigt skålen för att fördela PFA jämnt.
Inkubera i rumstemperatur i exakt 10 minuter. Tillsätt sedan 0,47 milliliter 1,25 molar glycinlösning till skålen och inkubera vid rumstemperatur i fem minuter för att stoppa ytterligare korsbindning. Efter att ha tvättat cellerna enligt manuskriptet, skrapa cellerna och överföra cellupphängningen till ett 1,5 milliliter mikrocentrifugrör.
Centrifugera röret med cellupphängningen vid 3, 000 gånger g i fem minuter vid rumstemperatur för att återvinna cellpelleten. Använd en pipett för att helt ta bort PBS. Registrera cellnumret per rör, och förvara cellpelleten vid minus 80 grader Celsius.
För att utföra celllys, tina först de lagrade VCaP-cellpelletsen på is. Tillsätt 300 mikroliter av den beredda ChIP-cellens lysbuffert kompletterad med PIC till varje rör, och resuspend pelleten noggrant. Vortexa röret i 15 sekunder, och inkubera suspensionen på is i 10 minuter.
Centrifugera vid 9, 000 gånger g i tre minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten helt, och tillsätt 300 mikroliter av MNase digestionsbuffert för att återanvända pelleten. Späd MNase med MNase digestionsbuffert i ett 1,5-milliliter rör för att ge 50 gelenheter per mikroliter.
Tillsätt den utspädda MNase till suspensionen, och inkubera vid 37 grader Celsius i exakt 10 minuter. Ställ in blandningen genom inversion var 2 1/2 minut. För att avsluta MNase matsmältningen, tillsätt 30 mikroliter av 0,5-molar EDTA vid pH åtta, och virvel kort.
Efter inkubation i fem minuter på is, centrifug vid 9, 000 gånger g i fem minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten helt, och resuspend pelleten i 300 mikroliter av den beredda ChIP-spädningsbufferten kompletterad med PIC. Sedan, på en sonicator utrustad med en mikrotopp sond, ställa in ultraljudsbehandling villkor till amplitud två, bearbetad tid 15 sekunder, puls PÅ fem sekunder, och puls OFF 30 sekunder.
Sonikera suspensionen på is. Rita en mikroliter av fjädringen, och plats på ett objektglas. Under ett mikroskop, observera för att säkerställa att cellstrukturen är nästan bruten.
Centrifugera röret vid 9, 000 gånger g i 10 minuter vid fyra grader Celsius, och överför supernatanten till ett nytt 1,5-milliliter mikrocentrifugrör. Spara 20 mikroliter av det smälta kromatin i en 1,5-milliliter skruvrör för ytterligare behandling, och lagra resten på minus 80 grader Celsius. Först, i varje 1,5-milliliter skruvrör, tillsätt 75 mikroliter vatten, fyra mikroliter av fem-molar natriumklorid, och en mikroliter proteinas K.To ta bort tvärbindning mellan protein och DNA, tillsätt 20 mikroliter av rötat kromatin från varje MNase matsmältningen villkor till ett skruvrör.
Stäng locket tätt, blanda helt och inkubera röret i 65 grader Celsius över natten. På morgonen, efter centrifugering röret vid två till 3, 000 gånger g i några sekunder, tillsätt 100 mikroliter pci. Vortex kraftfullt för att bilda en emulsion.
Centrifugera röret igen vid högsta hastighet i 30 sekunder vid rumstemperatur. Sedan, förbereda två 1,5-milliliter mikrocentrifugrör per villkor. Lägg till 100 mikroliter pci till ett rör.
Tillsätt 10 mikroliter av tre-molar natriumacetat vid pH 5.2 och två mikroliter av glykogen till ett annat rör. Från röret tas ut ur centrifug, försiktigt dra den övre fasen som innehåller DNA, och lägga till den i röret som innehåller PCI. Vortex kraftigt, och centrifug röret vid högsta hastighet i 30 sekunder vid rumstemperatur.
Därefter överför den övre fasen till röret som innehåller natriumacetat och glykogen beredd tidigare. Tillsätt 250 mikroliter av etanol, och blanda genom inversion. Inkubera i 10 minuter i rumstemperatur.
Centrifugera röret vid högsta hastighet i 30 minuter vid fyra grader Celsius. Bekräfta pellets på botten av röret. Ta försiktigt bort supernatanten för att inte störa pelleten, och tillsätt 500 mikroliter med 70%etanol.
Centrifugera röret vid högsta hastighet i fem minuter vid fyra grader Celsius. Ta bort supernatanten helt, och torka pelleten i cirka fem minuter i rumstemperatur. Tillsätt sedan 20 mikroliter TE för att lösa upp pelleten.
Mät DNA-koncentrationen med hjälp av en UV-spektrofotometer. Efter beredning av smält kromatin, tina alla prover på is. Tillsätt 1200 mikroliter av den beredda ChIP-spädningsbufferten kompletterad med PIC för att späda ut rötskromatin till koncentrationen av fem mikrogram per 500 mikroliter.
Tillsätt fem mikroliter av det utspädda rötade kromatin till ett 1,5-milliliter skruvrör som ett ingående prov. Förvara provet vid minus 80 grader Celsius. Tillsätt 500 mikroliter var av det utspädda rötade kromatin till ett 1,5-milliliter skruvrör som ett immunoprecipitationsprov.
Tillsätt två mikrogram antikroppar till varje rör, och stäng locket. Inkubera rören i fyra grader Celsius över natten med försiktigt blandning på en gungande plattform. På morgonen, tillsätt 30 mikroliter av ChIP-grade protein G magnetiska pärlor till varje rör.
Inkubera rören igen vid fyra grader Celsius i två timmar med skonsam blandning. Efter det, snurra ner röret kort vid två till 3, 000 gånger g, och placera röret i en polyeten rack som innehåller neodymmet magneter i en minut. Sedan försiktigt ta bort supernatanten genom aspiration.
Därefter lägger du till 0,5 milliliter lågsalt immunkomplex tvättbuffert till varje rör. Kort virvel röret för att skingra pärlorna. Inkubera röret i fyra grader Celsius i fem minuter med skonsam blandning på en gungande plattform.
Upprepa tvätten med högsalt immunkomplex och litiumklorid immunkomplex enligt manuskriptet. När du har tagit bort resterande supernatant helt, tillsätt 150 mikroliter av elueringsbuffert till röret. Vortexa röret för att skingra pärlorna helt.
Stäng locket, och inkubera röret i 65 grader Celsius i 30 minuter. För att skingra pärlorna noggrant, blanda genom inversion var femte minut. Under inkubationen, förbereda en 1,5-milliliter skruvrör, och tillsätt sex mikroliter av fem-molar natriumklorid och två mikroliter proteinas K.Thaw den 1%input provet tidigare beredd på is.
Tillsätt 150 mikroliter elueringsbuffert, sex mikroliter av fem-molarnatriumklorid, och två mikroliter proteinas K till ingående prov. Efter inkubationen av röret som innehåller pärlor, snurra ner. Placera röret i ett magnetiskt rack i en minut, och överför supernatanten till skruvröret som innehåller natriumklorid och proteinas K.Representative mikrobildsgrafier av korslänkade cellpellets före och efter ultraljudsbehandling visar distinkta skillnader.
Utan ultraljudsbehandling förblir cellstrukturen intakt, vilket indikerar att kromatin finns i kärnorna. En kort ultraljudsbehandling bryter cellstrukturen. Crosslinked kromatin var beredd från VCaP celler och smält med olika mängder MNase.
Utan att lägga till MNase, ett utstryk mönster med en mycket hög molekylvikt dök upp. Tillsats av MNase gav en stege mönster, som visar att MNase smälter internukleosom. Endast det villkor som producerade kromatin fragment upp till 900 bp kan anses vara korrekt matsmältning, medan en olämplig matsmältning mönster visar översmältning främst resulterade i mononucleosome produktion.
Matsmältningsmönster av kromatin i VCaP celler indikerar korrekt matsmältning av kromatin. Den högsta beläggningen av H3K4methyl3 observerades runt 0,5 kilobase och en kilobase uppströms AR-TSS. Regioner som ligger på 19 kilobase och åtta kb uppströms och 12 kilobase nedströms AR-TSS, hade dock liten beläggning av H3K4methyl3, vilket tyder på att dessa kan användas som negativa regioner.
Att bestämma MNase matsmältningen tillstånd är viktigast. Underhåll cellnummer, buffertvolym och enzymmängd i varje experiment. Villkoret måste identifieras för varje celltyp.
Vi kan utföra ChIP sekvensering för globala beläggning av de faktorer och kromatin konformation fångar att bestämma interaktioner mellan distala genomiska skador. Denna metod kunde avslöja processmekanismer av transkriptionen. ChIP-analys är ett kraftfullt verktyg för att undersöka transkriptionell reglering, men det är besvärligt och inte reproducerbart.
Vår metod uppmuntrar forskare att utföra analysen rutinmässigt och enkelt.
Related Videos
You might already have access to this content!
Please enter your Institution or Company email below to check.
has access to
Please create a free JoVE account to get access
Login to access JoVE
Please login to your JoVE account to get access
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Please enter your email address so we may send you a link to reset your password.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Your JoVE Unlimited Free Trial
Fill the form to request your free trial.
We use/store this info to ensure you have proper access and that your account is secure. We may use this info to send you notifications about your account, your institutional access, and/or other related products. To learn more about our GDPR policies click here.
If you want more info regarding data storage, please contact gdpr@jove.com.
Thank You!
A JoVE representative will be in touch with you shortly.
Thank You!
You have already requested a trial and a JoVE representative will be in touch with you shortly. If you need immediate assistance, please email us at subscriptions@jove.com.
Thank You!
Please enjoy a free 2-hour trial. In order to begin, please login.
Thank You!
You have unlocked a 2-hour free trial now. All JoVE videos and articles can be accessed for free.
To get started, a verification email has been sent to email@institution.com. Please follow the link in the email to activate your free trial account. If you do not see the message in your inbox, please check your "Spam" folder.
